大黄素键合硅胶柱高效液相色谱法分离酸性芳香族化合物

许丽丽， 林泽玲

(韩山师范学院化学系，广东潮州 521041)

酸性芳香族化合物广泛存在于各类中草药、中成药、西药制剂和保健食品中，具有抗菌、消炎、止痒、清热、解毒、抗风湿、麻醉等功效，因此对各类药物和保健品中有效芳香酸成分和含量的分离分析以及药物代谢动力学的研究，一直是科研工作者关注的热点之一[1 - 4]。目前高效液相色谱法(HPLC)是药物、食品检测比较主流的方法[5]。我国药典中，有超过1 000种药物的质量控制采用了反相高效液相色谱法。C18色谱柱因具有柱效高、稳定性好、适用范围广和使用方便等优点而成为最常用的反相色谱柱[6]，并已经用于多种常见酸性芳香族化合物的分离分析[1 - 3,7]。然而，C18柱分离强极性溶质并不理想，单一的疏水作用机制使其对于部分芳香酸的保留时间太短，以致分离度有限从而不得不采用梯度洗脱、离子对试剂或其它更复杂的方法来改善分离效果。因此，开发更适合分离该类溶质的反相色谱固定相十分必要。研究发现，含有多种作用位点的固定相能与强极性溶质发生多种相互作用，具有良好的色谱分离选择性，是较理想的分离强极性溶质的色谱固定相[8 - 10]。

本实验室采用中间体法，以5 μm球形硅胶为载体，γ-[(2,3)-环氧丙氧]丙基三甲氧基硅烷(KH-560)为偶联剂，制备了大黄素键合硅胶液相色谱柱(ESP柱)，并展示了ESP柱在极性样品分离中的良好选择性[11]。本实验以14种酸性芳香族化合物为溶质，以C18和苯基柱作为参照，侧重考察ESP柱对芳香酸类强极性化合物的分离能力，以及流动相中甲醇含量和pH值对分离的影响，探讨其色谱分离机理，为ESP柱的实际应用提供实验基础。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent1260高效液相色谱系统(美国，Agilent公司)，包括四元泵、柱温箱、二极管阵列检测器、OpenLAB CDS ChemStation工作站和手动进样器；ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(150×4.6 mm，5 μm)，ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl色谱柱(250×4.6 mm，5 μm)。大黄素键合硅胶色谱柱(150×4.6 mm，5 μm，自制)。

甲醇(色谱纯，西陇化工股份有限公司)，间苯三酚等酸性芳香族化合物(分析纯，上海化学试剂总厂)，其它试剂均为分析纯。实验用水为二次蒸馏水。

复方水杨酸搽剂(上海运佳黄浦制药有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1ESP柱的制备大黄素键合硅胶固定相的制备参照本课题组前期报道的方法[11]，经结构表征后，采用匀浆法装入空色谱柱中，从而制得ESP柱。测得大黄素配体键合量为0.23 mmol/g，ESP柱理论塔板数约为1 9874N/m。

1.2.2色谱分析方法流动相使用前先过滤，再超声脱气15 min。溶质用甲醇溶解后经0.45 μm的滤膜过滤，浓度范围为50～250 mg/L，进样体积为5 μL。以甲醇溶剂峰的保留时间为死时间，柱温为32 ℃，流速为0.8 mL/min，检测波长230 nm，至少平行测定2次。

2 结果与讨论

2.1 ESP对酸性芳香族化合物的分离

2.1.1ESP柱分离间苯三酚等5种酸性混合物由图1可见，除对甲苯磺酸外，其它4种酸性溶质混合物在ESP柱上与在C18柱和苯基柱上的保留顺序一致，即间苯三酚<邻苯二酚<对硝基苯酚

图1 间苯三酚等5种化合物在ESP柱(a)、C18柱(b)和苯基柱(c)上的色谱图Fig.1 Chromatograms of m -trihydroxybenzene and other four acidic compounds on ESP(a),C18 (b) and phenyl (c) columnmobile phase:Methanol-0.02 mol·L-1KH2PO4=70∶30(V/V),pH=2.5;1.m-trihydroxybenzene,2.o-dihydroxybenzene,3.p -nitrophenol,4.2-anilinobenzoic acid,5.p -toluene sulfonic acid.

2.1.2ESP柱分离异烟酸等5种酸在相同的色谱条件下，考察了异烟酸等5种芳香酸在ESP柱、C18柱和苯基柱上的色谱行为，如图2所示。5种芳香酸在C18柱和苯基柱上的保留顺序一致、保留时间也较接近。而5种溶质在ESP柱上的色谱行为却显著不同。由于对氨基苯磺酸中含有磺酸根，在5种溶质中极性最强，在C18柱和苯基柱上保留最弱(k′=0.01和0.39)。而在ESP柱上对氨基苯磺酸则是5种溶质中保留最强(k′=5.59)的。这是由于ESP柱上的酚羟基、羰基和蒽醌环与磺酸根发生了较强的氢键作用、偶极-偶极作用和p-π电荷转移等作用，这些作用力的影响远远超过了对氨基苯磺酸疏水性的不足。这种现象与前面发现的ESP柱对对甲苯磺酸的强保留现象相吻合。同时，多种作用位点的协同作用也使得苦杏仁酸和间苯二甲酸在ESP柱上的保留时间(k′=1.94，3.62)明显长于C18柱(k′=0.59，1.07)和苯基柱(k′=1.18，1.62)。说明ESP柱具有与C18柱和苯基柱明显不同的分离选择性。

图2 异烟酸等5种酸在ESP柱(a)、C18柱(b)和苯基柱(c)上的色谱图Fig.2 Chromatograms of isonicotinic acid and other four acidic compounds on ESP(a),C18(b) and phenyl(c) columnmobile phase:methanol-0.02 mol·L-1KH2PO4=50∶50(V/V),pH=2.5;1.isonicotinic acid,2.p -aminobenzoic acid,3.mandelic acid,4.m-phthalic acid,5.p -aminobenzenesulfonic acid.

2.1.3ESP柱分离烟酸等4种酸实验考察了烟酸、苯甲酸、桂皮酸和对苯二甲酸在ESP柱、C18柱和苯基柱上的分离情况(流动相为甲醇-0.02 mol·L-1KH2PO4体积比55∶45,pH=2.5;图略)。4种酸在C18柱和苯基柱上的分离主要是基于疏水性顺序为：烟酸<对苯二甲酸<苯甲酸<桂皮酸。另一羧基引入苯甲酸会进一步增大其极性，所以在C18柱和苯基柱上对苯二甲酸先于苯甲酸被洗脱。而在ESP柱上，羧基与配体的氢键作用和电荷转移作用强于引入羧基带来的疏水性削弱造成的影响，使得疏水性弱的对苯二甲酸反而比苯甲酸和桂皮酸保留更强。多种作用机制使ESP柱与C18柱和苯基柱对溶质的保留具有不同的选择性，对苯二甲酸在ESP柱(k′=3.03)上的保留强于C18柱(k′=0.51)和苯基柱(k′=1.27)。

2.2 分离酸性芳香化合物的主要影响因素

2.2.1流动相中甲醇含量的影响三组酸性化合物在ESP柱上的保留因子k′与流动相中甲醇含量的关系如图3所示。随着流动相中甲醇含量的增加，大部分溶质的保留时间缩短但并不呈现简单的线性关系，说明ESP柱对大部分酸性化合物的保留主要是基于疏水作用，但是其它的作用机制对溶质在ESP柱上的分离有显著影响。这表现为：随着甲醇含量的增加，烟酸与异烟酸在ESP柱上的保留时间不是缩短而是小幅度地增大；对甲苯磺酸的k′与甲醇含量关系曲线呈现“U”型(与文献报道[10]的现象类似)；对氨基苯磺酸在ESP柱上的保留基本上不随甲醇含量的增加而变化。这些异常现象主要是由于流动相中甲醇含量过高使得流动相实际pH值发生了较大变化，已不是原来pH=2.5的环境，同时非疏水作用表现明显。

图3 流动相中甲醇含量对溶质保留因子的影响Fig.3 The effect of methanol content in mobile phases on the retention factors of the solutesMethanol-0.02 mol·L-1KH2PO4(pH=2.5);(a) peaks identifications are the same as in Fig.1;(b) peaks identifications are the same as in Fig.2;(c):1.nicotinic acid,2.benzoic acid,3.cinnamic acid,4.p-phthalic acid.

2.2.2流动相pH值的影响图4为三组酸性化合物的保留因子k′随流动相pH值变化的关系曲线。由图可见，由于间苯三酚、邻苯二酚和对硝基酚的pKa(分别依次为8.45，9.45和7.15)不在所考察的流动相pH值变化范围之内(2.5～6.5)，故其保留因子变化很小。而其它11种芳香酸，其pKa为-2.8～4.92，它们的保留很大程度地取决于本身的pKa及溶液pH值变化。由于以下四种因素的影响，芳香酸在ESP柱上的保留随pH的变化情况较复杂：(1)随着pH值的增大，芳香酸溶质易电离，极性增强，疏水性降低，保留值减小；(2)随着pH值的增大，ESP柱固定相中的酚羟基可能发生解离从而固定相带负电荷，与羧酸阴离子相排斥，原有的氢键作用也大大减弱，从而溶质保留值减小；(3)随着pH值的增大，羧酸阴离子苯环上的电子云密度大于中性分子，溶质与大黄素配体的π-π作用增强，又使溶质保留值增大；(4)N-苯基邻氨基苯甲酸、烟酸和异烟酸分子中含有亚氨基或吡啶环，随着pH值的增大，溶质分子中的N去质子化，溶质极性变小，保留变强。图4显示，三组酸性化合物在pH=3.5或4.5时各溶质分离度相对较好，但实验发现间苯二甲酸和对苯二甲酸等溶质在pH≥4.5时由于酸解离得不到有效抑制导致色谱峰展宽变形，各溶质在流动相pH=2.5时的峰形优于pH=3.5时，因此流动相为pH=2.5较适合ESP柱对芳香酸的分离。

图4 流动相中pH值对溶质保留因子的影响Fig.4 The effect of pH value in mobile phase on the retention factors of the solutes Methanol-0.02 mol·L-1 KH2PO4:(a)70∶30,(b)50∶50,(c) 55∶45(V/V);peaks identifications are the same as in Fig.1(a),Fig.2(b) and Fig.3(c),respectively.

2.3 ESP分离实际样品复方水杨酸搽剂

图5 复方水杨酸搽剂在ESP柱上的色谱图Fig.5 Chranatogram of compound salicylic acid liniment on ESPmobile phaste:Methanol-0.02 mol·L-1KH2PO4=65∶35(V/V),pH=2.5；1.m-dihydroxybenzene,2.phenol,3.methyl salicylate,4.salicylic acid.

将复方水杨酸搽剂用甲醇稀释后过0.45 μm滤膜，然后直接进样检测。四种主要成分在ESP柱上的洗脱顺序为：间苯二酚<苯酚<水杨酸甲酯<水杨酸(图5)。而相同条件下，在C18柱和苯基柱上的洗脱顺序为：间苯二酚<苯酚<水杨酸<水杨酸甲酯，水杨酸甲酯由于羧基被酯化，疏水性增强，在C18柱和苯基柱比水杨酸保留强。而水杨酸上的羧基与ESP柱存在较强的氢键和偶极作用，这种作用强过疏水作用的影响，导致在ESP中水杨酸的保留强于水杨酸甲酯，这与文献[10]和[12]中的报道相似。而苯基柱由于缺少羟基和羰基等作用基团，氢键作用极弱，保留顺序与C18柱一致。综上，ESP柱适合用于复方水杨酸搽剂等酸性实际样品的分离分析。

3 结论

上述结果表明，由于C18柱与溶质作用机制单一，在对芳香酸等强极性溶质的分离中保留均较弱。苯基柱虽然与溶质间除了能发生疏水相互作用还具有π-π作用，但在对芳香酸的分离中的选择性和保留强度与C18柱无明显区别。而ESP柱对溶质的分离主要基于疏水作用，但同时能与溶质发生π-π或p-π电荷转移作用、氢键作用以及偶极-偶极作用，其对芳香酸的分离选择性和保留有别于常规的苯基和C18柱，可有效用于易电离的芳香酸等极性化合物的分离分析，同时有望作为制备色谱材料用于芳香酸类有效药物成分的分离、纯化和富集。