聚酰胺纯化刺头复叶耳蕨总黄酮的研究

李辉敏

（九江学院基础医学院，江西 九江 332000）

聚酰胺纯化刺头复叶耳蕨总黄酮的研究

李辉敏

（九江学院基础医学院，江西 九江 332000）

目的 研究聚酰胺树脂纯化刺头复叶耳蕨总黄酮的工艺条件。方法 以总黄酮的吸附率、纯化率为评价指标，考察聚酰胺树脂对刺头复叶耳蕨总黄酮的吸附和洗脱条件。结果 所得最佳纯化工艺：上样液pH值为5，上样溶液黄酮质量浓度调节为2.0 mg/ml，以70%乙醇为洗脱剂，洗脱流速为2.0 BV/h。结论聚酰胺树脂能有效富集、纯化刺头复叶耳蕨总黄酮。关键词：刺头复叶耳蕨；总黄酮；聚酰胺树脂；纯化工艺

刺头复叶耳蕨（Arachniodes exilis Ching）为鳞毛蕨科复叶耳蕨属植物，广泛分布于世界热带和亚热带湿润区域，在我国主要分布于长江流域以南地区，具有清热利湿、抗菌消炎等作用，民间用于治疗急性黄疸型肝炎、痢疾、烫火伤等，其主要化学成分为黄酮类化合物［1］。有研究表明鳞毛蕨类植物有包括抗病毒、抗肿瘤等药理作用，产生这些药理作用的成分为黄酮类化合物［2］。本研究经过预实验摸索，在参考文献的基础上［3，4］，选择60-90目的聚酰胺来纯化刺头复叶耳蕨总黄酮，建立纯化工艺，为刺头复叶耳蕨总黄酮的开发研究提供科学依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

刺头复叶耳蕨采自江西省星子县，经九江学院高春华教授鉴定为鳞毛蕨科（Dryopteridaceae）复叶耳蕨属（Arachniodes）刺头复叶耳蕨（Arachniodes exilis Ching）的根茎。对照品：芦丁（中国生物制品检定所，批号100080-200306）；Al（NO3）3，上海科思精密化学品公司；60-90目聚酰胺，河北沧州化工有限公司；其他所有试剂（均为分析纯），汕头市西陇化工有限公司。

1.2 仪器

电子分析天平（BT224S型），德国赛多利斯；紫外可见分光光度计（TU-1901），北京普析通用仪器有限责任公司；旋转蒸发仪（RE-52AA），上海亚荣生化仪器厂；真空干燥箱，上海精密仪器有限公司。

2 方法

2.1 总黄酮含量测定

利用紫外-可见分光光度法，以芦丁为标准品，采用Al（NO3）3显色法，在486.4 nm波长下测定标准曲线［5］，得到线性回归方程：Y=0.0121X-0.0322，R2=0.9998，线性关系在17.20～ 68.80 μg/ml范围内。根据标准曲线法测定各样品中总黄酮的含量。

2.2 刺头复叶耳蕨总提取物溶液的制备

取一定量刺头复叶耳蕨根茎粉末以60%乙醇，固液比1∶20，超声提取3次，每次超声提取时间为30 min。将所得提取液经过滤后减压浓缩至一定浓度，冷冻干燥得复叶耳蕨总提取物干燥粉末，测定该固体粉末中总黄酮含量为46.45%。取200 mg复叶耳蕨总提取物冻干粉用蒸馏水定溶于100 ml容量瓶，超声溶解，摇匀即得供试品溶液。

2.3 聚酰胺预处理

取60-90目的聚酰胺用95%乙醇浸泡24 h，用乙醇冲洗至洗出液加蒸馏水无白色浑浊，再用大量的蒸馏水洗至无醇味。

2.4 聚酰胺纯化条件的选择

2.4.1 上样液pH值选择 取供试品溶液10 ml各5份，分别滴加稀盐酸或稀氢氧化钠溶液调pH值为3、4、5、6、7。另外分别取2.0 g已预处理好的60-90目聚酰胺树脂5份，湿法装柱，取10 ml供试品溶液上样，控制流速为2.0 BV/h进行动态吸附，用蒸馏水洗至Molish反应呈阴性，再用70%乙醇进行洗脱至洗脱终点，收集洗脱液，减压浓缩成浸膏后定容于25 ml容量瓶中，测定吸光度，计算聚酰胺树脂的吸附率。

2.4.2 上样液浓度选择 分别取2.0 g已预处理好的60-90目聚酰胺树脂3份，湿法装柱，精密吸取不同质量浓度的刺头复叶耳蕨总提取物溶液各10 ml，控制流速为2.0 BV/h进行动态吸附，用蒸馏水洗至Molish反应呈阴性，再用70%乙醇进行洗脱至洗脱终点，收集洗脱液，减压浓缩至20 ml，测定吸光度，计算聚酰胺树脂的吸附率。

2.4.3 洗脱溶剂选择 分别取2.0 g已预处理好的60-90目聚酰胺树脂5份，湿法装柱，取10 ml供试品溶液上样，控制流速为2.0 BV/h，用蒸馏水冲洗至清洗液的Molish反应无现象，再分别用浓度为10%、30%、50%、70%、90%的乙醇进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩成浸膏后定容于25 ml容量瓶中，测定吸光度，优化筛选洗脱溶剂。

2.4.4 泄露曲线考察 取2.0 g已预处理好的60-90目聚酰胺树脂，湿法装柱，加入100 ml供试品溶液，取蒸馏水进行冲洗，直至清洗液的Molish反应无现象。在流速为2.0 BV/h的条件下，取70%乙醇对树脂中所吸附的刺头复叶耳蕨总黄酮进行解吸附，收集洗脱液，以每10 ml为一个流份，减压浓缩成浸膏后定容于100 ml容量瓶中，分别依法测定吸光度，以累计总体积为横坐标、吸光度为纵坐标绘制泄露曲线，确定最佳上样量。

2.4.5 洗脱流速选择 取2.0 g已预处理好的60-90目聚酰胺树脂3份湿法装柱，取10 ml供试品溶液上样，取蒸馏水进行冲洗，直至清洗液的Molish反应无现象。分别控制流速为1.0、2.0、3.0 BV/h，取70%乙醇对树脂中所吸附的刺头复叶耳蕨总黄酮进行解吸附。收集洗脱液，减压浓缩至20 ml，测定其黄酮含量，计算解吸附率。

2.4.6 验证试验 取样品溶液3份，按以上所得最佳条件进行分离纯化，测定计算所得黄酮洗脱率，并计算RSD值。

3 结果

3.1 上样液pH值选择

结果见图1，上样液pH值变化可影响聚酰胺树脂的吸附率。当pH=5.0时聚酰胺树脂的吸附率最大。当溶液pH值高于样品溶液中黄酮类成分的pKa值时，样品易以盐的形式而不以游离状态存在，不利于吸附；而当溶液pH值低于4时，吸附率较低，这可能是由于黄酮类成分在酸性过强的条件下转变为佯盐，不利于吸附。当pH=5.0时，样品溶液中黄酮类化合物保持分子状态，以游离形式存在，易被吸附，故此pH条件下吸附量最大。

图1 上样液pH值对聚酰胺树脂吸附率的影响

3.2 上样液浓度选择

结果见图2，聚酰胺树脂对样品溶液中黄酮的吸附率随着上样溶液浓度的增加而有所降低，提示样品溶液中黄酮质量浓度较低时易于吸附与解吸附，同时考虑上样体积增加对生产效率有一定降低作用。本研究最终选择将样品溶液黄酮质量浓度调节为2.0 mg/ml后进行纯化。

图2 上样液浓度对吸附率的影响

3.3 洗脱溶剂选择

结果见图3，乙醇浓度低于70%时，对聚酰胺树脂柱上黄酮的洗脱作用较弱，而当乙醇浓度高于70%时，对黄酮的洗脱作用增加不明显，从节省溶剂等方面考虑，最终选择以70%乙醇作为聚酰胺树脂纯化条件下的洗脱溶剂。

图3 不同洗脱溶剂对聚酰胺树脂解吸附率的影响

3.4 泄露曲线考察

结果见图4，当上样量过载时，黄酮发生泄漏，随清洗液流出，当用蒸馏水清洗到第8个流份时，所得累计流份中黄酮含量几乎不再发生变化，证明此时过载的黄酮已随清洗液全部流出。计算清洗液中黄酮含量，可知2 g聚酰胺树脂对黄酮的饱和吸附量为79 mg，所以要求每克聚酰胺树脂总黄酮上样量不能超过39 mg。

图4 泄露曲线

3.5 洗脱流速选择

结果见图5，洗脱流速分别为1.0、2.0、3.0 BV/h时，吸附率相应有一定程度的下降。当洗脱流速为1.0 BV/h时，吸附与解吸作用最好。同时考虑到洗脱时间的控制，生产效率的提高，本研究最终选择2.0 BV/h作为洗脱流速。

图5 流速对吸附率的影响

3.6 纯化工艺验证

精密称取已经预处理的聚酰胺树脂2 g各3份，湿法装柱；按上述实验所得到的最佳纯化工艺条件（即上样液pH值为5，上样溶液黄酮质量浓度调节为2.0 mg/ml，以70%乙醇为洗脱剂，洗脱流速为2.0 BV/h）进行验证实验，平行3次，收集洗脱液，减压浓缩后按标准溶液配制方法显色得到待测溶液，测定吸光度，计算总黄酮的洗脱率，结果显示：平均洗脱率为79.50%，RSD为3.98%，表明该纯化工艺稳定可行（见表1）。该纯化后的溶液经减压浓缩冷冻干燥后得到的干燥粉末中黄酮含量为71.64%，比纯化前提高了25.19%。

表1 刺头复叶耳蕨总黄酮纯化工艺验证结果（%）

4 结论

本研究建立了以聚酰胺树脂纯化的方法获得刺头复叶耳蕨总黄酮，得出其最佳纯化工艺条件：上样液pH值为5，上样溶液黄酮质量浓度调节为2.0 mg/ml，以70%乙醇为洗脱剂，洗脱流速为2.0 BV/h，洗脱率可达到79.50%。该条件下所得洗脱液经减压回收溶剂，冷冻干燥后得到黄酮含量为71.64%的刺头复叶耳蕨总黄酮冻干粉。聚酰胺树脂纯化条件的建立为刺头复叶耳蕨中黄酮成分的纯化提供了依据，从而为进一步研究刺头复叶耳蕨中黄酮成分的药理活性提供基础。

［1］周道年，阮金兰，蔡亚玲.复叶耳蕨地上部分黄酮类化合物［J］.中国药学杂志，2008，43（16）：1218-1220.

［2］李辉敏.复叶耳蕨属植物研究进展［J］.九江医学，2009（3）：91-93.

［3］胡军萍，依再提古丽·司马义，杨建华.酒花黄酮的纯化工艺［J］.食品科学，2013，34（12）：40-44.

［4］吴新荣，刘志刚，颜仁梁，等.聚酰胺颗粒分离纯化土茯苓总黄酮研究［J］.中药材，2009，32（10）：1606-1609.

［5］张玉祥，邱蔚芬，银杏叶超声波提取工艺研究［J］.时珍国医国药，2006，17 （5）：784-785.

R285.5

A

1671-1246（2015）09-0104-03

注：本文系江西省教育厅资助项目（GJJ12737）；江西省卫生厅资助项目（2012A014）