牛布鲁氏菌病不同血清学检测方法的比较分析

赵凤菊，刘坤洋，于学武，闫明媚，李井春，张雅为，顾贵波

（辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳110164）

牛布鲁氏菌病不同血清学检测方法的比较分析

赵凤菊，刘坤洋，于学武，闫明媚，李井春，张雅为，顾贵波

（辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳110164）

布鲁氏菌病的诊断主要采用细菌学和血清学方法，但因细菌学方法费时、费力、危险性高，血清学方法便成为布鲁氏菌病诊断的主要方法。本研究利用RBPT、SAT、CFT、i-ELISA和c-ELISA检测试剂盒对270份牛血清样品进行检测，评价不同检测方法对我国布鲁氏菌病的诊断价值。试验结果表明：RBPT检测为阳性的样品数量最多；SAT与CFT两种试验方法差异显著，漏检率可达23.17%～24.39%；i-ELISA、c-ELISA方法与RBPT的符合率、阳性检出率均高于SAT和CFT；i-ELISA、c-ELISA方法与SAT和CFT两种方法综合判定结果无显著差异；i-ELISA与c-ELISA两种检测方法无显著差异。

虎红平板凝集试验；试管凝集试验；补体结合试验；ELISA方法

布鲁氏菌病（Brucellosis）简称布病，是由布鲁氏菌侵入机体后引起的传染-变态反应性人畜共患病[1]，是国际贸易检疫中必检的一种传染病。本病在世界范围内广泛流行，近年来在全球范围内，呈现较高的发病率[2-3]。该病不仅给畜牧业造成巨大的经济损失，而且给消费者带来严重的公共威胁[4]。目前，我国动物布病监测中主要采用国标中规定的虎红平板凝集试验（RBPT）、全乳环状试验（MRT）、试管凝集试验（SAT）和补体结合试验（CFT）。20世纪80年代我国就有关于ELISA方法在布病诊断方面的研究，但只有用于牛布鲁氏菌病诊断的ELISA检测方法是世界动物卫生组织（OIE）规定的国际贸易指定试验之一[5]。

本研究对保存的牛血清样品同时使用RBPT、SAT、CFT、间接ELISA（i-ELISA）和竞争ELISA（c-ELISA）5种血清学检验法进行检测，通过试验比较不同检测方法的差异，探讨不同检测方法在牛布病诊断中的意义。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及试剂盒布鲁氏菌虎红平板凝集抗原、布鲁氏菌试管凝集抗原、布鲁氏菌补体结合试验抗原、溶血素、补体、标准阴性血清及标准阳性血清，均购自中国疾病预防控制中心传染病预防控制所。i-ELISA和c-ELISA试剂盒购自瑞典SVANOVA公司，批号分别为：P01448、P01418。0.5%石炭酸生理盐水、绵羊红细胞等其他试剂均由辽宁省动物疫病预防控制中心配制。

1.2 血清样本临床样品为未经免疫的牛血清样品，共270份，其中RBPT阳性样品205份，RBPT阴性样品65份。

1.3 试验器材微量移液器、三分玻璃试管、酶标仪（TECAN）、酶标板自动清洗剂（DEM-Ⅲ）、试管架、振荡器、37℃恒温培养箱等。

1.4 试验方法及判定标准

1.4.1 RBPT、SAT、CFT RBPT、SAT、CFT试验方法及判定标准参照我国《动物布鲁氏菌病诊断技术》（GB/T 18646-2002）。

1.4.2 i-ELISA和c-ELISA试验步骤严格按照试剂盒说明书操作。

1.5 统计分析方法试验结果使用Excel进行录入，对RBPT、SAT、CFT、i-ELISA和c-ELISA试验结果应用SPSS 17.0软件进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 SAT与CFT的比较用SAT与CFT方法对RBPT筛选出的205份阳性血清样本和65份阴性血清样本进行检测，检测结果见表1。结果表明：205份RBPT阳性血清样本SAT检测出108份阳性样本、42份可疑和55份阴性样本，65份RBPT阴性血清样本用SAT检测均为阴性，与RBPT的符合率为63.70%；205份RBPT阳性血清样本CFT检测出121份阳性样本、3份可疑和81份阴性样本，65份RBPT阴性血清样本用CFT检测均为阴性，与RBPT的符合率为68.89%，SAT与CFT的符合率为60.98%；205份RBPT阳性血清样本采用SAT与CFT相结合的方法，最终判定为146份阳性、18份可疑和41份阴性，SAT的阳性符合率为73.97%，CFT的阳性符合率为82.88%，Kappa值为0.663。利用SPSS 17.0软件对SAT与CFT两种试验方法试验结果进行统计学分析，χ2(1,0.95)值为11.57，Kappa值为0.327，SAT与CFT检测结果统计学差异极其显著（P＜0.01）。

表1 SAT与CFT的检测结果比较Table1 Comparison of detection results about SAT and CFT

2.2 RBPT与ELISA方法的比较用ELISA方法对RBPT筛选出的205份阳性血清样本和65份阴性血清样本进行检测，检测结果见表2。利用SPSS 17.0软件对不同试验方法的试验结果进行统计学分析，结果表明：205份RBPT阳性血清样本i-ELISA检测出157份阳性、48份阴性，65份RBPT阴性血清样本均为阴性，与RBPT的符合率为82.22%，χ2（1,0.95）值为46.02，Kappa值为0.617，RBPT与i-ELISA检测结果统计学差异极其显著（P＜0.01）；205份RBPT阳性血清样本c-ELISA检测出156份阳性、49份阴性，65份RBPT阴性血清样本均为阴性，与RBPT的符合率为81.85%，χ2(1,0.95)值为47.02，Kappa值为0.611，RB-PT与c-ELISA检测结果统计学差异极其显著（P＜0.01）；i-ELISA与c-ELISA两种试验方法的符合率为93.33%，χ2(1,0.95)值为0.056，Kappa值为0.865，i-ELISA与c-ELISA检测结果无统计学差异。

表2 RBPT与ELISA方法的检测结果比较Table2 Comparison of detection results about RBPT and ELISA

2.3 ELISA方法与SAT和CFT方法综合判断结果的比较对RBPT筛选出的205份阳性血清样本，通过SAT检测为阳性的样本判为阳性。对SAT检测为阴性的样本再通过CFT进行检测，CFT检测为阳性的判为阳性，检测为阴性的最终判为阴性。通过对ELISA方法检测结果与SAT和CFT方法综合判断结果进行比较，i-ELISA、c-ELISA方法与SAT和CFT综合判定结果的符合率分别为80.37%、83.33%。利用SPSS 17.0软件对SAT与CFT综合判定结果和i-ELISA、c-ELISA的检测结果进行分析，结果表明：SAT和CFT综合判定结果与i-ELISA、c-ELISA的χ2（1,0.95）值分别为1.53、0.97，Kappa值分别为0.589、0.476，约登指数分别为0.728和0.846，均无统计学差异。

表3 SAT和CFT方法综合判定结果与ELISA方法检测结果的比较Table3 Comparison of detection results about comprehensive comparison judgment detection results of SAT and CFT with the ELISA

3 讨论与小结

目前，血清学方法仍为动物布病检测的主要方法，在我国动物布病的诊断中主要使用RBPT进行初筛，SAT、CFT相结合的方法进行确诊的诊断程序。通过本试验发现，应用RBPT对布病牛的检出率明显高于SAT、CFT与ELISA方法，同时因RBPT具有特异、敏感、廉价、操作简便的特点被广泛应用于本病的初筛诊断。但因严重溶血、试验温度、交叉反应或抗原抗体反应超过4 min后出现纤维素的凝集块，有时会产生假阳性结果[6]。因此，还需要通过已建立的确证体系进行最终的判定。

SAT、CFT为我国布病诊断的法定试验，其中CFT还是世界动物卫生组织（OIE）规定的国际贸易指定的布病的确诊试验之一。SAT检测IgM敏感性较高，不仅可以用于布病的早期诊断，也可以用于人畜布鲁氏菌菌苗免疫后机体出现最早血清抗体的检测[7]，但不适用于犬种和绵羊附睾种布鲁氏菌感染动物的检测，且操作繁杂、费时、结果判定受主观因素影响大，单独使用时特异性较差，不能区分人工免疫和自然感染[8]。CFT主要适用于动物机体感染中、后期的实验室诊断，但CFT不适合作为猪的布病检测，同时由于CFT条件要求较高，操作复杂，参与的成份多，对操作者要求也比较高，且不能鉴别人工免疫和自然感染，也难以在基层应用以及进行现场检测。于桂芳等[9]通过对奶牛布鲁氏菌病试管凝集试验与补体结合试验结果的差异分析发现，如果只把补体结合试验作为奶牛布病监测的最终判定结果，将有35.9%试管凝集阳性奶牛被漏判为阴性。通过本试验也发现SAT与CFT这两种试验方法统计学差异极其显著，一致性较低，如果只用其中一种方法进行诊断会出现误诊、漏诊现象，漏检率可达到23.17%～24.39%。因此，对于布病的确诊不能单纯依靠SAT或CFT一种方法，还需要采用SAT和CFT相结合的方法进行综合判定。

ELISA方法在布病诊断方面作为一种相对较新的血清学诊断技术，在诊断操作特性上与CFT效果相当，甚至敏感性和特异性更好，操作简单且比较稳定，判定时用酶标仪，避免了人为因素的干扰[10]，适于畜群筛选和动物个体检查。通过本试验发现，i-ELISA、c-ELISA方法与RBPT的符合率、检测为阳性的样品数量均高于SAT和CFT；i-ELISA、c-ELISA方法与SAT和CFT两种方法综合判定结果无显著差异，且具有较好的一致性。i-ELISA与c-ELISA两种方法的一致性也相当好，两种检测方法的检测结果无统计学差异。虽然i-ELISA高度敏感，但不能鉴别牛种布鲁氏菌19号苗免疫接种产生的抗体或其它假阳性问题和自然病原菌株诱导产生的抗体。因此，在检测时i-ELISA可以作为一种筛选方法而不是确诊方法。c-ELISA较i-ELISA特异性更高，可以消除部分由细菌交叉反应引起的非特异性反应，并可以排除绝大多数牛种布鲁氏菌19号苗免疫接种产生的残留抗体的反应。因此，c-ELISA可以作为本病的确诊方法之一。

由此可见，虽然布病的血清学诊断方法种类很多，但目前还没有任何一种方法无论在敏感性、特异性还是在操作简便、易行、快速等方面是完美无缺的。在实际检验工作中还需要用两种或两种以上的方法相结合。尤其在进行大规模检验时，需要选择操作简便、快速、敏感性高的检测方法进行初步筛选，再选用敏感性、特异性好的诊断方法进行确诊。

[1]董文杰，解英波.布鲁氏菌病3种血清学检测方法比较分析[J].中国卫生检验杂志，2014，24（23）：3405-3406.

[2]司瑞，徐志凯.布鲁氏菌国内研究进展[J].地方病通报，2006，5（21）：80-82.

[3]赵娜，赵赤鸿，荣蓉.布鲁氏菌病血清学Brucellacapt和i-ELISA检测方法的比较[J].中国人兽共患病学报，2014，30（10）：1045-1047，1051.

[4]孙岩，肖培，王娜，等.倍比稀释虎红平板凝集试验对布鲁氏菌病诊断的探讨[J].中国媒介生物学及控制杂志，2014，25（4）：294-296.

[5]高明华，张志琰，李跃，等.布鲁氏菌病实验室诊断研究进展[J].中国人畜共患病学报，2010，26（1）：81-83，87.

[6]李慧.布鲁氏菌病的血清学检测方法比较[J].中国畜牧兽医文摘，2013，29（3）：46-47.

[7]李玲，王勤，曹培义.常规试管凝集试验与虎红平板试验判定布氏杆菌病的比较[J].中国卫生检验杂志，2013，23（7）：1749-1750.

[8]王佳，徐卫民.布鲁氏菌病血清学诊断研究进展[J].中国病原生物学杂志，2008，3（2）：149-152.

[9]于桂芳，温富勇，王国良，等.奶牛布鲁氏菌病试管凝集试验与补体结合试验结果的差异分析[J].北京农业，2007，24：27-28.

[10]杨正玉，王波，李桂杰.牛布鲁氏菌病诊断方法的比较试验[J].中国畜牧兽医文摘，2014，30（6）：53.

Comparative analysis detection methods of bovine brucellosis in different serological

Zhao Fengju,Liu Kunyang,Yu Xuewu,Yan Mingmei, Li Jingchun,Zhang Yawei,Gu Guibo

(Prevention and Control Center of Liaoning Province Animal Epidemic Disease,LiaoningShenyang110164)

Bacteriological and serological methods were commonly applied to diagnose brucellosis.But the bacteriological method was time consuming,laborious,and high-risks.Therefore,the erological methods had become the main method to diagnose brucellosis.In this study,RBPT,SAT, CFT,i-ELISA and c-ELISA were applied to dectect 270 bovine serum samples,to evaluate the diagnostic value of different methods for the brucellosis detection.The results showed that∶most tests was positive of RBPT;SAT and CFT methods were significantly different,which undetected rate could reach 23.17%～24.39%;the coincidence of i-ELISA,c-ELISA with RBPT was higher than that of the SAT and CFT;meanwhile,the positive detection rate was higher than that of the SAT and CFT. However,there was no significant difference between the comprehensive determination results of SAT,CFT and that of i-ELISA,c-ELISA;and there was no significant difference between i-ELISA and c-ELISA.

RBPT;SAT;CFT;ELISA

S858.23

B

1672-9692(2015)03-0012-04

2015-01-26

赵凤菊（1978-），女，高级兽医师，主要从事人畜共患病检测方面的工作。

辽宁省农业攻关支撑计划，编号：201404210