产海藻糖合酶菌株的筛选及发酵条件的优化

段莹莹，赵　伟，曹大鹏，张曰辉，崔巍巍

（山东福洋生物科技有限公司，山东德州253100）

产海藻糖合酶菌株的筛选及发酵条件的优化

段莹莹，赵伟，曹大鹏，张曰辉，崔巍巍

（山东福洋生物科技有限公司，山东德州253100）

从土壤中分离筛选得到一株能合成海藻糖的菌株，经生物转化途径验证，该菌株含有特异性地将麦芽糖转化为海藻糖的海藻糖合酶，以海藻糖转化率为评价指标，对其进行摇瓶发酵条件的优化。结果表明，其发酵最适条件为：碳源为2%麦芽糖，氮源为0.5%酵母粉和1%蛋白胨，发酵初始pH值为7.0，接种量4%，发酵温度35℃，发酵时间48 h，在此优化条件下，海藻糖的转化率为50%。

海藻糖，筛选，麦芽糖，发酵条件

海藻糖是功能性低聚糖，具有非还原性、保湿性、热酸稳定性、抗冻结、干燥性等特性［1］，而且它对生物大分子和生物体组织有着非特异性的保护作用［2-3］。海藻糖作为一种添加剂、稳定剂和甜味剂已经广泛应用于食品、化妆品和医药工业等领域［4］。但是，长久已来，海藻糖昂贵的价格一直制约着海藻糖在以上各个领域的广泛应用。生产海藻糖的方法较多，有微生物抽提法、从发酵液中提取、酶转化法和基因重组法［5-6］。酶法转化海藻糖一直是工业生产海藻糖的主要途径［7］，海藻糖合酶可通过转糖基作用直接将麦芽糖转化为海藻糖，在工业酶法生产海藻糖中最具优势，而探究产海藻糖合酶菌株的发酵条件是降低海藻糖生产成本的一条有效途径［8-12］。本研究从土壤中分离筛选得到一株能合成海藻糖的菌株，经生物转化途径验证，该菌株含有特异性地将麦芽糖转化为海藻糖的海藻糖合酶，以海藻糖转化率为评价指标，对其进行摇瓶发酵条件的优化［13］。为海藻糖工业化生产提供了理论依据和技术支持。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1菌种

土壤：取自山东福洋生物科技有限公司；菌株：从土壤中分离筛选。

1.1.2培养基

富集培养基：葡萄糖2%，酵母粉0.5%，蛋白胨1%，KH2PO40.5%，Mg2SO40.2%，链霉素0.003%，pH 6.5。

固体培养基：葡萄糖2%，酵母粉0.2%，Na2SO40.7%，CaCl20.7%，琼脂2%，pH 7.0。

发酵培养基：麦芽糖2%，酵母粉0.5%，蛋白胨1%，KH2PO40.3%，K2HPO41%，MgSO4·7H2O 0.12%，pH 7.0。

1.1.3试剂

海藻糖标准品、麦芽糖标准品、葡萄糖标准品：美国Sigma公司；乙腈（色谱纯）：西陇化工股份有限公司；蔗糖、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、酵母粉、蛋白胨：国药集团化学试剂有限公司；硝酸铵、氯化铵、硫酸铵：天津市河东区红岩试剂厂。

1.2仪器与设备

Waters515泵、Waters2414型示差折光检测器、N2000双通道色谱工作站的高效液相色谱仪：美国Waters公司；TP-114型电子天平：丹佛仪器有限公司；FE-20型pH计：梅特勒-托利多仪器有限公司；3K15型冷冻离心机：美国Sigma公司；AH-BASIC型匀浆机：ATS工业系统有限公司；DHZ-DA型冷冻恒温振荡器：太仓市实验设备厂；SW-CJ-2D型净化工作台：苏州净化设备有限公司。

1.3方法

1.3.1产海藻糖菌株的初筛

取2g土样，加入到100mL的富集培养基中，在35℃、220 r/min条件下进行富集培养，将富集后的菌液稀释成10-1、10-2、……10-7，涂布于固体培养基平板，35℃培养48 h，挑取大小、形状、颜色不一的具有典型特征的细菌单菌落，在固体培养基中进一步分离纯化，反复3次后，挑取典型细菌单菌落于斜面上划线，35℃培养48 h后于冰箱4℃保存，作为初筛斜面。

1.3.2产海藻糖合酶菌株验证试验

将初筛的菌株接种到发酵培养基上，35℃、220 r/min，摇床培养48 h，离心收集菌体，用pH 7.0的50 mmol/L磷酸钠缓冲液洗涤菌体2次后，加入与发酵液等体积的磷酸钠缓冲液混匀，匀浆机低温破碎菌体，获得粗酶液。加入麦芽糖溶液，混合后使麦芽糖终含量为30%，50℃、120 r/min转化反应12 h，煮沸10 min灭酶，离心收集上清液。

1.3.3产海藻糖菌株的鉴定

（1）菌落的形态特征

固体培养基35℃培养48 h后，菌落为圆形，乳白色，直径约1.5 mm，周边齐整，微凸，表面光滑，不透明，黏稠易挑起。

（2）菌株的生理生化特征

能利用葡萄糖、麦芽糖、海藻糖、蔗糖、糊精产酸，但不产气，不能利用乳糖和淀粉；能在低于10%NaCl的培养基中生长。

1.3.4分析检测

采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法［14-15］测定海藻糖、麦芽糖和葡萄糖的含量。色谱条件为：流动相：乙腈∶水=3∶1（V/V）；氨基色谱柱（250 mm×4.6 mm）；检测器：示差折光检测器；柱温：40℃；等度洗脱流速：1 mL/min；进样量：20 μL。

海藻糖标准曲线的制备：用超纯水分别配制质量浓度分别为0.6 g/L、1.2 g/L、1.5 g/L、1.8 g/L、2.0 g/L、2.4 g/L、3.0 g/L海藻糖的标准溶液，HPLC分析后绘制标准曲线，得到线性回归方程和相关系数（R2）。

海藻糖转化率的计算公式：

式中：C1为海藻糖的量，g；C2为麦芽糖的量，g。

1.3.5生物转化途径验证

将产酶菌株所得粗酶液分为3份，每份20 mL，分别加入20 mL 60%的麦芽糖溶液、20 mL 60%的葡萄糖溶液、20mL去离子水，均于50℃、120r/min反应12h后煮沸10 min灭酶，将3份反应液离心后取上清液，采用高效液相色谱法测定反应液中海藻糖、麦芽糖、葡萄糖的含量。

1.3.6发酵培养基的优化

碳源的确定：制备种子液按4%接种量接种于装液量为100 mL/500 mL发酵培养基中，分别以2%麦芽糖、2%葡萄糖、2%蔗糖作为碳源，其他成分同1.1.2发酵培养基，35℃、220 r/min、摇瓶培养48 h后，收集菌体破碎，制备粗酶液进行酶解反应转化，测定海藻糖转化率。

氮源的确定：制备种子液按4%接种量接种于装液量为100 mL/500 mL发酵培养基中，分别以0.5%酵母粉+1%蛋白胨、1.5%硝酸铵、1.5%氯化铵、1.5%硫酸铵作为氮源，其他成分同1.1.2发酵培养基，35℃、220 r/min摇床培养48 h后，菌体破碎，制备粗酶液进行酶解反应转化，测定海藻糖转化率。

1.3.7发酵工艺条件的优化

发酵温度的确定：将产酶菌株按4%接种量接种于装液量为100 mL/500 mL优化后的发酵培养基中，分别于30℃、35℃、40℃、45℃，220 r/min、摇床培养48 h后，菌体破碎，制备粗酶液进行酶解反应转化，测定海藻糖转化率。

发酵pH的确定：将产酶菌株4%接种量接种于装液量为100 mL/500 mL优化后的发酵培养基中，分别调节其初始pH 5.0℃、6.0℃、7.0℃、8.0℃，35℃、220 r/min摇床培养48 h后，收集菌体破碎，制备粗酶液进行酶解反应转化，测定海藻糖转化率。

接种量的确定：将产酶菌株按3%、4%、5%、6%接种量接种于装液量为100 mL/500 mL优化后的发酵培养基中，pH 7.0，35℃、220 r/min摇床培养48 h后，菌体破碎，制备粗酶液后进行转化，测定海藻糖转化率。

发酵时间的确定：将产酶菌株按4%接种量接种于装液量为100 mL/500 mL优化后的发酵培养基中，35℃、220 r/min摇床培养24 h、36 h、48 h、60 h后，菌体破碎，制备粗酶液后进行转化，测定海藻糖转化率。

2　结果与分析

2.1海藻糖标样的测定及海藻糖标准曲线的建立

2.1.1海藻糖标样的测定

应用高效液相色谱法测定海藻糖标样，色谱图见图1。

图1　海藻糖标样HPLC色谱图Fig.1 The HPLC chromatogram of trehalose standard

2.1.2海藻糖标准曲线的建立

分别以海藻糖含量（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，利用高效液相色谱法测定海藻糖含量的标准曲线如图2所示。

图2　海藻糖的标准曲线Fig.2 Standard curve of trehalose

由图2可知，海藻糖标准曲线的回归方程为y=243 394x+ 20 883，相关系数R2=0.999 2，表明海藻糖含量和峰面积呈良好的线性关系。

2.2海藻糖样品的测定

海藻糖粗酶液酶解反应转化48 h，煮沸10 min灭酶后，将转化液离心后取上清液，采用高效液相色谱法测定转化液中海藻糖的转化率，色谱图见图3。

图3　转化液HPLC色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of conversion solution

2.3菌株的筛选及产酶试验

从固体培养基中共筛选出16株菌株，标记为Q1-Q16。对筛选出来的16株典型菌株进行产酶试验，菌株代谢产海藻糖合酶试验结果如表1。

2 生物标志物的类型 生物标志物的范围非常广泛，可以是为检查器官功能或其他身体健康状况而引入生物体的物质，如氯化铷用于同位素标记检测心肌灌注情况；可以是用来表明特定疾病状态的物质，如受到疾病感染时抗体的出现；也可以是特异性细胞、分子或基因、基因产物、酶或激素，复杂的器官功能，生物特性或生物结构等。

表1　产海藻糖合酶菌株的选育Table 1 Screening of trehalose synthase producing strains

由表1可知，16株菌株中，有10株可定量检测到能利用麦芽糖生成海藻糖，其他6株检测不到，可能是菌株产的酶活力不好，生成的海藻糖很少，在这10株中，Q12的海藻糖转化率明显高于其他菌株，故作为本试验的目的菌株。

2.4生物转化海藻糖的途径

利用海藻糖合酶不作用于葡萄糖、麦芽三糖、麦芽寡糖、蔗糖、异麦芽糖、异麦芽寡糖等这一特点，以葡萄糖、麦芽糖、去离子水为不同的底物，通过对反应产物的定性定量分析对海藻糖的合成途径进行初步验证，测定结果见表2。

表2　不同底物反应体系的高效液相色谱法分析结果Table 2 HPLC analysis results of different substrate reaction system

由表2可知，底物为30%麦芽糖时，一部分的麦芽糖被转化生成了海藻糖，底物为30%葡萄糖时，并未检测到海藻糖的存在，通过3个体系的分析结果可知，此菌株在以麦芽糖为底物合成海藻糖的途径是通过海藻糖合酶完成的。

2.5菌株Q12发酵条件的研究

2.5.1碳源对海藻糖转化率的影响

图4　不同碳源对海藻糖转化率的影响Fig.4 Effect of different carbon sources on the conversion rate of trehalose

由图4可知，以2%麦芽糖为碳源时海藻糖转化率最高，为49.3%，这可能是由于酶的作用底物或底物类似物能诱导发酵产酶的原因，所以选择最适宜菌株产酶的碳源为2%麦芽糖。

2.5.2氮源对海藻糖转化率的影响

由图5可知，以0.5%酵母粉+1%蛋白胨为氮源时海藻糖转化率最高，为45.8%，这可能是有机氮源含有丰富的营养物质和蛋白质、肽类、游离的氨基酸以及少量的生长因子等可供微生物直接利用，有利于菌体生长产酶，所以菌株产酶的最适氮源为0.5%酵母粉+1%蛋白胨。

图5　不同氮源对海藻糖转化率的影响Fig.5 Effect of different nitrogen sources on the conversion rate of trehalose

2.5.3发酵温度对海藻糖转化率的影响

图6　发酵温度对海藻糖转化率的影响Fig.6 Effect of fermentation temperature on the conversion rate of trehalose

由图6可知，当发酵温度为35℃时海藻糖转化率最高，为47.1%，过高或过低的温度都不利于菌体生长和海藻糖的积累，最佳发酵温度为35℃。

2.5.4发酵初始pH对海藻糖转化率的影响

图7　发酵初始pH对海藻糖转化率的影响Fig.7 Effect of the initial pH on the conversion rate of trehalose

由图7可知，最佳发酵的初始pH为7.0，海藻糖转化率最高，为49.8%。较低的pH抑制菌株的生长，较高的pH有利于菌的生长而不利于海藻糖的积累。

2.5.5接种量对海藻糖转化率的影响

图8　接种量对海藻糖转化率的影响Fig.8 Effect of inoculum on the conversion rate of trehalose

由图8可知，最佳接种量为4%，海藻糖转化率最高，为48.2%。接种量＜4%时，发酵前期生长缓慢，延长发酵周期，接种量＞4%时，菌株较快达到了稳定期，自溶也快。

2.5.6发酵时间对海藻糖转化率的影响

图9　发酵时间对海藻糖转化率的影响Fig.9 Effect of fermentation time on the conversion rate of trehalose

由图9可知，发酵48 h时海藻糖转化率最高，为47.9%，随着发酵时间的延长，海藻糖转化率稍有下降，延长发酵时间并不能增加海藻糖的积累。因此，最佳发酵时间为48 h。

3　结论

通过筛选得到一株菌株Q12，其海藻糖转化率最高，并且确定了该菌株是以麦芽糖为底物通过海藻糖合酶途径合成海藻糖的。菌株Q12的最适发酵条件为：碳源为2%麦芽糖，氮源为0.5%酵母粉和1%蛋白胨，发酵初始pH值为7.0，接种量4%，发酵温度35℃，发酵时间48 h，在此优化条件下，海藻糖的含量为15.1%，海藻糖的转化率49.8%。

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Screening of trehalose synthase producing strain and optimization of its fermentation conditions

DUAN Yingying，ZHAO Wei，CAO Dapeng，ZHANG Yuehui，CUI Weiwei
（Shangdong Fuyang Biotechnology Co.，Ltd.，Dezhou 253100，China）

A trehalose synthase producing strain was isolated and screened from soil.Through biological transformation pathway identification，the strain contained trehalose synthase could convert maltose into trehalose.Using the conversion rate of trehalose as evaluation index，flask-shaking fermentation conditions were optimized.The results showed that the optimal fermentation conditions were maltose 2%as carbon source，yeast extract 0.5%and peptone 1%as nitrogen source，initial pH 7.0，inoculum 4%，fermentation temperature 35℃，fermentation time 48 h.Under this condition，the conversion rate of trehalose was 50%.

trehalose；screen；maltose；fermentation conditions

Q939.97

A

0254-5071（2015）10-0053-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.10.012

2015-09-06

段莹莹（1985-），女，工程师，硕士，研究方向为微生物发酵。