7对猪源性成分检测相关引物的特异性评测
2015-09-30顾佳瑛薛超波宋蓉林昕管峰
顾佳瑛 薛超波 宋蓉 林昕 管峰
摘 要：为了评测物种鉴定PCR体系的特异性及其影响因素，实验对猪源性成分鉴定相关的7对引物就退火温度、镁离子浓度和不同Taq酶的影响进行了研究。结果表明，退火温度和镁离子浓度对PCR特异性有着重要影响，而其中2对引物优化后仍与鼠、兔、牛、羊、鸡和鸭有非特异性扩增。不同的Taq酶对引物特异性也有重要影响，本实验中r Taq酶在7对引物PCR体系中特异性最佳。通过对引物体系的优化和选择不同的Taq酶，可以有效提高特异性，减少非特异性扩增，为建立物种鉴定的PCR体系及多重PCR提供了基础。
关键词：猪；物种鉴定；引物；特异性评测
中图分类号 S828.2 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2015）17-121-04
Assessment and Determination of Specificity of Seven Pairs of Primers for Porcine Identification
Gu Jiaying1 et al.
（1College of Life Science，China Jiliang University，Hangzhou 310018，China）
Abstract：To assess and determine the specificity of PCR system for species identification，seven pairs of primers for porcine identification were used to assess the effects of annealing temperature，concentration of MgCL2 and different Taq DNA polymerase on PCR specificity in this study. The results showed that there had two of seven pairs of primers had nonspecific amplification with rat，rabbit，bovine，ovine and chicken after optimization of PCR conditions. After PCR conditions were optimized for each pair of primers，including annealing temperature，concentrations of MgCL2 and dNTP，different Taq DNA polymerases. The PCR specificity was improved but not significantly. The results indicated that rTaq polymerase enzyme performed best to ensure the specificity of seven pairs of primers. This study could provide some guidance for development multiplex PCR methods of species identification.
Key words：Pig；Species identification；Primer；Specificity assessment
随着社会经济的发展，肉类已经成为人们食品来源的重要组成部分，现代肉类加工业及食品行业的快速发展更是促进了肉类食品多样化的快速发展。肉类食品掺假问题一直是大家非常关注的话题，由于近几年来各种“假羊肉”和欧洲马肉风波等多个制假掺假肉类事件屡禁不止，消费者对肉类质量与安全性的关注和要求也越来越高。尽管世界各国都在加强对肉食品的监管监督，但世界范围内的食品掺假仍然有不断增加的趋势，在一定程度上影响了消费者对食品行业的信心。近些年来，我国查处了多起用廉价的或者不合格的猪肉、鸡鸭肉甚至狐狸肉等冒充牛羊肉制品在市场销售事件。肉类掺假问题不仅损害消费者的经济利益，更重要的是可能危害消费者的身体健康，甚至会带来一些宗教信仰等社会问题，因此，对肉类掺假的检测就显得尤为重要。另外，牛羊的肉骨粉由于“疯牛病”的潜在隐患，也是世界动物卫生组织明令禁止的[1]。在检测方面，国内外制定了诸多对于常见肉类的检测方法标准，我国也有牛羊猪等物种成分的检测方法[2-5]，但大部分动物源性成分鉴定的现行国家标准存在诸如检测效率低、对于未知物种无法检测、对仪器要求高等不足，在检测应用的同时无疑增加了检测成本。
在物种鉴定方法发展过程中，基因组DNA尤其是线粒体DNA（mtDNA）由于具有稳定性好、不受组织来源和外在形态等影响的特点，逐渐成为了DNA分析技术中的首选靶标，也是当今“DNA条形码”技术的首选靶标。如今，PCR及其衍生技术作为DNA检测的主要手段被广泛应用，而引物的特异性和试剂是影响PCR特异性的主要因素[6-8]。多重PCR技术在物种鉴定中具有快速简便的优越性，但多重PCR体系也对引物的特异性和体系的稳定性提出了更高的要求。为了评测PCR体系特异性的影响，本研究对猪源性成分鉴定相关的6对和1对自行设计的PCR引物进行了特异性和影响因素评测，探究PCR特异性的影响因素，为建立多重PCR提供参考。
1 材料和方法
1.1 供试材料及试剂 牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、牛蛙、鱼（鲫鱼和小黄鱼）均购自超市肉类专柜；兔肉、水牛血样和小鼠肝脏为实验室保存的研究样品。按照动物组织或血液DNA提取试剂盒指导提取基因组DNA，用TE溶解后放4℃备用。r Taq DNA聚合酶和Ex Taq DNA聚合酶购自TaKaRa公司、Easy Taq DNA Polymerase购自TRANS公司、Dream Taq酶购自Fermentas公司，DNA Taq酶和高保真Taq酶购自Thermofisher公司，其他试剂均为国产常用分子生物学试剂。DNA提取后用NanoDrop 2000 UV-Visspectrophotometer进行质量检测，测定浓度和A260/280值。
1.2 引物设计 本研究选用了6对来自文献与猪检测相关的引物和1对自己设计的猪源性成分特异性鉴定引物，引物序列和文献来源等信息见表1。
表1 猪的检测引物信息
[引物
编号＼&基因序列
（5′-3′）＼&检测
对象＼&文献
来源＼&引物
对I＼&GCCTAAATCTCCCCTCAATGGTA＼&猪＼&[5，9，10]＼&ATGAAAGAGGCAAATAGATTTTCG＼&引物
对II＼&AATTTTTGGGGATGCTTAGACT＼&猪＼&[11]＼&TATTTTGGGAGGTTATTGTGTTGTA＼&引物
对III＼&GAAAAATCATCGTTGTACTTCAACTACA＼&猪＼&[12，13]＼&GGTCAATGAATGCGTTGTTGAT＼&引物
对IV＼&CTGGTCTTGTAAACCAGA＼&猪、牛、
羊＼&[14]＼&CCATCGAGATGTCTTATTTAAGAGG＼&引物
对V＼&CCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA＼&猪＼&[15]＼&GCTGATAGTAGATTTGTGATGACCGTA＼&引物
对VI＼&ACGCCAATCTACCACAAA＼&猪＼&自己设计＼&TGGCTGGCACGAGATTTA＼&引物
对VII＼&AAGACGAGAAGACCCTTGGACTTTA＼&多物种＼&[16，17]＼&GATTGCGCTGTTATCCCTAGGGTA＼&]
1.3 PCR参考条件及特异性评 依据文献报道的PCR条件，在既定条件下测试PCR体系对于物种DNA的非特异性扩增情况，依此评测引物的特异性，具体PCR体系和程序参阅表1各文献。引物对VI的反应体系为20μL，其中Buffer缓冲液2.0μL，上下游引物各2.0μL，dNTP 1.6μL，Taq DNA聚合酶0.2μL，MgCl2 1.6μL，DNA模板3.0μL（约含30ng DNA），ddH2O补充至20.0μL。反应程序为95℃变性5min；95℃变性30s，退火58.5℃、30s，72℃延伸30s为一个循环，共计30个循环；然后72℃保持5min。其测试所用DNA模板包括水牛、奶牛、山羊、绵羊、鹿、鸡、鸭和鱼类。PCR产物经电泳后使用凝胶成像仪进行观察。经PCR扩增后获得目标产物与预期大小一致且条带清晰则认为特异性好，反之亦然。
1.4 PCR条件优化及特异性检测 针对如上7对引物，按照20μL的PCR体系，进行退火温度（45～65℃）、MgCL2浓度（1.5～3.0mM）、引物浓度（0.05～1μM）和dNTP浓度的优化，猪DNA模板添加量固定为约30ng。条件优化后同样以水牛、奶牛、山羊、绵羊、鹿、鸡、鸭和鱼类的DNA为模板，测试PCR体系的特异性。
1.5 不同DNA聚合酶对PCR体系特异性的影响 为筛选特异性好且成本较低的试剂材料，用优化后的PCR体系对7对引物使用不同的DNA Taq聚合酶进行PCR扩增，筛选Taq酶与PCR体系的组合，所用Taq酶包括r Taq DNA聚合酶和Ex Taq DNA聚合酶、Easy Taq DNA Polymerase、Dream Taq酶、EX Taq酶、Easy Taq DNA Polymerase和Thermofisher公司的DNA Taq酶以及高保真Taq酶。实验重复3次。
2 结果
2.1 基因组DNA检测 对提取的基因组DNA检测结果表明，浓度在80～220ng/μL，A260/280在1.78～2.08，电泳条带有部分拖尾现象。
2.2 固有条件下特异性检测结果 按照文献报道的PCR体系和反应程序，使用Takara公司的EX Taq酶对各引物PCR体系特异性评测。其中引物对I可以特异性扩增猪基因组DNA，产物大小为212bp，且条带清晰，对羊、鸡、鸭、鼠、兔DNA没有非特异扩增，但是对牛DNA有非特异性扩增。引物对II对猪DNA有特异性扩增，扩增产物大小为712bp，与牛、羊、鸡、鸭、鼠、兔DNA没有非特异扩增产物（如图1所示）。引物对III虽然也可以特异性扩增猪DNA，扩增产物大小为100bp，但与牛、羊、鸡、鸭、鼠、兔DNA都有非特异扩增，且条带明显。根据文献报道，引物对IV是一对多物种检测引物，可以特异性的扩增牛、羊、猪DNA，结果证明对牛、羊、猪均有特异性扩增，猪的扩增产物大小为605bp，牛的扩增产物大小为662bp，羊的扩增产物大小为915bp，但对鼠、兔DNA有明显的非特异扩增（如图2所示）。引物对V对猪DNA有特异性扩增，扩增产物大小为387bp，对牛、羊DNA也有非特异扩增，但同等条件下电泳显示的条带亮度比猪的产物明显要弱。引物对VI可特异性扩增猪DNA，产物大小为420bp，但对兔有很弱的非特异性扩增。引物对VII是针对16S rRNA基因设计的引物，可以扩增多个物种的基因组，本实验中该引物可特异性扩增所有基因组DNA，其中猪的扩增产物大小为239bp，牛、羊的扩增产物大小为234bp，鸡的扩增产物大小为249bp，与预期结果一致（如图3所示）。
图1 引物对II PCR产物检测
注：M为GM334 DNA marker；1-7依次为：牛、羊、猪（712bp）、鸡、鸭、鼠、兔。
图2 引物对IV PCR产物检测
注：M-GM334 DNA maker；1-7依次为：猪（605bp）、牛（662bp）、羊（915bp）、鼠、兔、鸡、鸭。
图3 引物对VII PCR产物检测
注：M-GM334 DNA maker；泳道1-10：猪、牛、水牛、羊、鸡、鸭、牛蛙、鱼、鼠、兔。
2.3 条件优化后的特异性检测结果 对具有非特异性扩增的引物体系进行PCR优化。优化后引物对I能扩增猪DNA而对本测试中其他物种无扩增。引物对III优化后在退火温度达到66.5℃时对猪DNA仍有很好的特异性扩增，扩增产物大小为100bp，但仍无法消除对牛DNA的非特异性扩增。引物对IV优化后特异性扩增牛、羊、猪DNA，但值得注意的是，该引物在提高镁离子浓度和退火温度后，兔的非特异性扩增产物条带亮度显著降低，仍无法完全消除对兔和鼠DNA的非特异性扩增，需降低电泳分辨率才能消除这种非特异性扩增的影响。引物对V在优化后仍无法消除对牛羊DNA的非特异性扩增，而引物对VI优化后对猪之外的测试物种无非特异性扩增。引物对VII是一个多物种扩增的引物，对测试物种能在宽泛的PCR条件下扩增动物的16S rRNA基因，是一个很好的可供用于动物基因组检测的参照基因。
2.4 不同酶对特异性的影响 Taq酶是PCR反应的重要成分，对PCR的特异性和扩增量有着直接影响，不同的酶在活性、保真性和性价比方面差异较大[7]。本实验中在用TaKaRa公司的EX Taq酶对上述7对引物扩增后，更换Taq酶进行PCR反应，结果表明，针对引物对I在其他条件不变的情况下，r Taq酶具有相对较高的特异性和经济性，相比EX Taq酶减少了牛的非特异扩增。引物对VI在其他条件不变的情况下，使用r Taq酶和Thermofisher公司的DNA Taq酶时引物的特异性无显著变化，但是目的扩增产物电泳亮度显著提高，当PCR程序降低至26个循环时非特异性扩增在电泳中不可见。在其他5对引物PCR反应体系中，r Taq酶和Thermofisher公司的DNA Taq酶以及高保真Taq酶都能特异性扩增目的物种的DNA，且不同Taq酶之间的扩增效果无明显差别。
3 讨论
近几年，肉类食品掺假问题层出不穷，备受社会关注，不法商贩为谋求利益，将相对便宜的猪肉、鸡鸭肉甚至狐狸肉等进行处理，冒充价格较贵的牛羊肉或做成休闲食品。肉类掺假问题不仅影响经济、食品营养价值和食品安全等，还带来一系列社会问题，影响社会诚信，并且可能带来一些宗教信仰问题。另外，动物饲料中添加明令禁止的牛羊源成分现象屡有发生，也给动物养殖行业带来了潜在风险。因此，动物源性成分溯源鉴定是当今社会监督监管和严格执法的需要。
物种鉴定或饲料中动物源性成分的鉴定经历了感官检验和形态学检验的过程，随后发展了蛋白质分析方法，如ELISA法、免疫法、等电聚焦等方法。但在肉类加工的过程中，由于腌制、蒸煮、混合或者加入各种调料会使蛋白质的结构和稳定性遭到破坏，物种特有的蛋白质或抗原决定部位也会遭到破坏，因此对于深加工后的肉类蛋白分析法存在不足，如ELISA法难以对混合肉的物种进行鉴别[18]。核酸分析是伴随着蛋白成分检测发展起来的物种鉴定技术，主要是PCR及衍生技术，由于PCR反应时间较短、操作简单、成本低，并且有较高的灵敏度和特异性，成为了物种鉴定中最常用的的技术[19]。PCR技术目前已经发展了多种技术，在物种鉴定研究中得到广泛应用，目前多个物种如猪[2，5]、牛羊[2，4]等都采用了PCR鉴定技术。PCR技术的特异性和灵敏度除了引物外还受到反应体系内所有试剂的影响，包括DNA模板浓度和质量、DNA聚合酶、MgCL2浓度等。DNA模板的质量是影响PCR的重要因素，模板DNA中目的基因的原始拷贝数对PCR结果有着重要的影响，浓度较高、结构完整且杂质少的DNA模板可提高PCR效率。模板DNA提取过程中有机溶剂的残留会影响DNA聚合酶的活性而影响扩增效率。在物种检测和溯源研究中有时候由于获得微量样品，DNA提取存在不可重复性，因此往往需要对PCR体系进行优化，以达到最大化扩增DNA模板的效果。本研究中使用了动物组织作为DNA提取的材料，尽管样品来源和处理不同，从实验结果来看提取的DNA质量足以满足本研究的需要。另一方面，由于本研究中PCR均以mtDNA为靶标，由于mtDNA的稳定性好，本研究中所有提取的DNA均能满足PCR扩增的需求。同时合适的MgCL2浓度是保证Taq酶活性的基本条件，其浓度的优化可以提高PCR体系的特异性。Taq酶对PCR体系特异性的影响较为显著，Taq酶种类和特点以及自身的5′→3′聚合酶活性和外切酶活性以及3′→5′外切酶活性对于PCR的特异性都存在影响[7-8]。本研究中的EX Taq酶具有3′→5′外切酶活性，可对dNTP的错配进行校正，保真性好，但是扩增效率并不高。与此同时，EX Taq酶的扩增条件更为严格，温度范围和镁等离子浓度范围更窄，PCR特异性与严格的条件优化有关，否则难免有非特异性扩增。rTaq酶没有3′→5′外切酶活性，保真性相对较低，但它的扩增条件较为宽泛，在本实验测试中相对特异性较好。本实验经过对比7对猪源性成分鉴定相关的PCR引物，测试结果表明，实验条件中温度、镁离子浓度和不同批次及厂家的Taq酶对PCR的特异性均有影响，其中温度、镁离子浓度2个条件可以通过PCR优化降低影响，提高特异性。而不同酶的测试表明，不同的酶有不同的活性，对PCR特异性造成一定影响，因此，要根据扩增产物片段大小以及实验需求来选择合适的Taq酶。
综上研究表明，在物种PCR鉴定中应注意镁离子浓度、退火温度和不同Taq酶的选用，通过优化镁离子浓度、退火温度和选择合适的Taq酶可以有效提高检测的准确性。同时本研究也为将来建立多重PCR检测多物种的方法提供了基础。
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（责编：张宏民）
