吉林地区尖锐湿疣疣体内高危型人乳头瘤病毒的检测与分型

丛乐乐，崔传信，杨宏凤，赵 晴，李晓丽

（吉林大学中日联谊医院，吉林 长春130033）

尖锐湿疣（CA），是由人乳头瘤病毒（HPV）感染所致的以生殖器部位增生性损害为主要表现的疾病，具有较强的传染性和较高的复发率，并以亚临床感染的形式存在于人体中，根据致癌性的高低，将HPV分为低危型、高危型，感染型别多为低危型，多无癌变倾向，高危型HPV持续感染是99%以上宫颈癌发生的必要条件［1］。各地区流行病学调查研究发现，不同地区不同人群的HPV感染型别有着较大的区别，对尖锐湿疣患者HPV感染亚型的调查，可对患者的治疗预后进行有效的判断，具有极其重要的临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象 2012年3月至2014年2月就诊于自吉林大学第三医院的皮肤科门诊尖锐湿疣患者，记录患者姓名，性别，年龄，疣体位置，大小，形态，病史，治疗史。

1.1.2 标本收集 对经临床和醋白试验证尖锐湿疣患者，签知情同意书，局麻，剪取3mm×3mm大小疣体组织。将其放入备有1ml无菌生理盐水的试管中，标记，放入－20℃冰箱中冷藏备用。

1.1.3 试剂与仪器 高危型人乳头瘤病毒（HPV）分型核酸测定试剂盒（上海之江生物科技股份有限公司）。ABI Prism®7000型荧光定量PCR仪。

1.2 方法

采用HPV13种型别的特异性引物及荧光探针，应用聚合酶链式反应（PCR）结合Tapman技术，对HPV13种型别的特异性DNA核酸片段进行分型检测。

1.2.1 样本DNA提取 取约50mg组织于试管中，置室温解冻，研磨，加入1ml生理盐水，充分震荡摇匀，将液体转移至1.5ml离心管中，以13，000 rpm离心5min。沉淀加无菌生理盐水1ml混匀，以13，000rpm离心5min，弃上清。沉淀后直接加入100μl核酸提取液充分混匀，沸水浴10min后13，000rpm离心5min，取上清4μl作为PCR反应模板。

1.2.2 质量控制 H2O检测结果应为仪器FAM、VIC通道Ct栏均显示UNDET（ABI Prism®7000）或循环阈值栏均显示40（SLAN荧光定量PCR检测系统），阳性对照品检测结果应为Ct值≤35，否则实验视为无效。结果判断Ct值等于40.0或UNDET的样本为阴性，Ct值≤35的检测样本为阳性。

2 结果

2.1 HPV感染型别分布 280例疣体样本中，HPV高危型阳性例数为76例，感染率为27.14%。检测的13种亚型均有出现。检出率前7位感染的HPV亚型分别为 HPV16，18，59，58，56，33，39。见表1。

表1 HPV感染的型别分布（前7位）

2.2 HPV高危型多重感染分布 280例尖锐湿疣患者共检测出高危型HPV 76例，其中单一型感染35例（46.1%），多重感染41例（53.9%）。其中二重感染21例，（27.6%）；三重感染14例，（18.4%）；四重感染4例，（5.3%）；五重感染2例，（2.6%）

2.3 不同年龄段HPV高危型感染率比较 本研究共收集280例尖锐湿疣患者，年龄最小20岁，最大67岁，平均37.6岁，年龄中位数为37岁，20－29岁102例，占36.4%。50岁以上32例。见表2。

表2 尖锐湿疣患者性别及年龄分布（n/%）

可见，20－29岁为高发年龄段，均高于其他各组。采用SPSS11.5χ2统计分析软件分析，不同年龄段男女患者发病情况无显著性差异（P＞0.05）。

3 讨论

3.1 HPV高危型单一感染和多重感染的情况HPV由于各种亚型之间编码外壳蛋白是基因变异较大，不同亚型病毒之间基本上没有交叉保护性抗体，容易造成不同亚型HPV的多重感染和多次感染，HPV多重感染发生宫颈癌的风险比单一型别感染增加1.5倍［2］。本实验中尖锐湿疣组织中共检测出高危型 HPV感染率为27.14%（76/280），多重感染高达53.9%（41/76）。关于HPV多重感染是否会增加宫颈癌的风险，目前尚无统一意见，但更多学者倾向认为，HPV多重感染更易导致宫颈病变，增加宫颈癌的风险。

3.2 HPV感染的高发年龄 有研究表明，在292例HPV阳性的尖锐湿疣患者中，HPV构成比以20－29岁年龄段最高［3］。雷振春等［4］在780例尖锐湿疣患者中证明HPV阳性构成比最高的年龄段在20－29岁，与本文相符。但是从统计学上来说，20－29岁年龄段与30－39岁年龄段的发病率并无差异，两个年龄段的发病率相加高达68.57%。由此可见，20－39岁为HPV感染的高发年龄。其原因可能与该年龄段的患者性生活相对频繁有关系。

3.3 荧光定量PCR检测HPV基因型意义 荧光定量 PCR （Quantitative Real－time PCR）是 一 种 在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析。实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每轮循环均可检测荧光信号强度，并记录，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。能一次性检测出多种不同的基因序列，具有快速、简便、高效、高敏感性、高特异性等特点，尤其适用于基因分型、病原体的检测等方面。因此适于研究HPV感染的流行病学和正常人HPV感染筛查。

3.4 HPV相关疾病的流行病学调查 经流行病学调查发现，宫颈癌、肛门癌和外生殖器癌、喉癌与HPV 的相关性约为100%、85%、50%［5］。2004－2008年在美国，每年有新的HPV相关口咽鳞癌病例报告多达12000例，过去20－30年里增长了高达225%［6］。有学者认为，HPV－16在HNSCC的进程中是至关重要的因素［7］。阴茎癌最常见于50－70岁左右的男性，在发展中国家有着较高的患病率，约10%。在侵袭性阴茎肿瘤组织中HPV16高达60.2%，是最常见的型别，其次为 HPV18（13.3%）［8］。宫颈癌是妇女发病率较高的恶性肿瘤，全球每年新发宫颈癌患者约为45万人，有22万人死于该病［9］。

综上所述，高危型HPV与多种肿瘤的发生、发展密切相关。因此，HPV分型检测是宫颈癌等病变筛查的必要手段。通过分型检测进行个体化评估，预测肿瘤发生的风险度，从而决定筛查的间隔，选择和制定治疗方案。结果也可为监测疫苗的效果及为未来制作相应型别的疫苗提供理论依据。

［1］Richa Tripathi，Gayatri Rath，et al.Clinical Impact of De－Regulated Notch－1and Notch－3in the Development and Progression of HPVAssociated Different Histological Subtypes of Precancerous and Cancerous Lesions of Human Uterine Cervix［J］.PLoS One，2014，9（6）：e98642.

［2］Lee SA，Kang D，Seo SS，et al.Multiple HPV infection in cervical cancer screened by HPV DNA Chip［J］.Cancer Lett，2003，198（2）：187.

［3］阮建波，陈冬萍，朱瑞清.302例尖锐湿疣患者人乳头瘤病毒基因型检测及分析［J］.皮肤性病诊疗学杂志，2011，18（1）：37.

［4］雷振春，郑一斐，汪英俊，等.尖锐湿疣患者人乳头瘤病毒的感染与基因分型研究［J］.中华医院感染学杂志，.2015，25（7）：1475.

［5］Giuliano AR，Tortolero－Luna G，Ferrer E，et al.Epidemiology of human papillomavirus infection in men，cancers other than cervical and benign conditions［J］.Vaccine，2008，26（Suppl 10）：K17.

［6］Wu X，Watson M，Wilson R，et al.Human papillomavirus－associated cancers－United States，2004 – 2008［J］.Morb Mortal Wkly Rep，2012，61（15）：258.

［7］Vietía D，Liuzzi J，Avila M，et al.Human papillomavirus detection in head and neck squamous cell carcinoma［J］.Ecancermedicalscience，2014，23；8：475.

［8］Miralles－Guri C，Bruni L，Cubilla AL，et al.Human papillomavirus prevalence and type distribution in penile carcinoma［J］.J Clin Pathol，2009，62：870.

［9］Parkin DM，Bray FI，Devesa SS.Cancer burden in the year 2000：the global Picture［J］.Eur J Cancer，2001，37：S4.