多种方法检测视神经脊髓炎患者血清及脑脊液中水通道蛋白4抗体的临床应用

李 敏，秦新月

（1.重庆市第七人民医院 神经内科，重庆400054；2.重庆医科大学附属第一医院 神经内科，重庆400016）

水通道蛋白4抗体（anti－aquaporins 4，AQP4－Ab）是近年来发现的对于视神经脊髓炎（nuromylitis optica，NMO）有较高特异性及敏感性的检验指标［1］，可用于与多发性硬化（multiple sclerosis，MS）的鉴别。临床上对水通道蛋白4抗体的检测方法的研究较为广泛，目前的检测方法有细胞免疫共沉淀法、放射免疫共沉淀法、组织间接免疫荧光检测、细胞免疫荧光法及酶联免疫吸附测定法等［2］，各种方法优缺点不同。我院采用了后3种方法对125例患者的血清及脑脊液进行检测分析，以此为临床应用提供依据，结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

我院2009年1月至2014年12月收治的58例多发性硬化患者（MS组）及67例视神经脊髓炎患者（NMO组），年龄37－54岁，平均45.4±8.6岁，其中男38例，女87例。纳入排除标准：①两组患者分别符合NMO诊断标准［3］及 MS诊断标准［4］；②由两名以上主任医师做出诊断；③排除同时合并其他器质性或功能性神经系统疾病者；④排除疾病缓解期患者或1月内有免疫抑制剂及糖皮质激素治疗者。50例健康受试者（对照组）均来自我院健康体检中心。本次研究通过医院伦理委员会批准，健康受试者、患者及家属均签署知情同意书。

3组间性别、年龄差异无统计学差异，NMO组患者与MS组患者间性别组成、年龄、起病年龄、病程均无统计学差异（P＞0.05），具有可比性。详见表1。

表1 两组患者一般情况比较

1.2 样本采集与处理

所有共175例研究对象采集非抗凝血2ml，离心（4℃2 500r/min，20min）后去上清液，于－20℃保存备用。125例NMO与MS患者入院后行腰椎穿刺检查，留取脑脊液标本0.2ml与血清一同保存。

1.3 检测方法

组织间接免疫荧光检测（indirect immunofluorescence assay，IIF）：参照检测方法［5］，应用视神经（猴）/AQP4试剂盒（欧蒙医学实验诊断股份公司，德国，批号：FAll2c－1005－1）检测 AQP4－IgG，具体操作步骤及阳性结果以说明书为标准。

细胞免疫荧光法（cell—based assay，CBA）：具体操作步骤参照检测方法［6］，待检测的血清及脑脊液标本与HEK－293T－AQP4细胞共同孵育后，采用荧光显微镜观察。由于AQP4为跨膜糖蛋白，即细胞膜出现绿色荧光为阳性结果。

酶联免疫吸附测定法（enzyme－linked im－munosorbent assay，ELISA）：采用抗AQP4抗体检测试剂盒（上海雅吉生物科技有限公司），具体操作步骤参照说明书。用酶标仪在450nm处读取吸光度。阳性结果以说明书为标准。

1.4 统计学分析

所有数据用SPSS 17.0软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，NMO组及MS组一般资料比较采用独立样本t检验；计数资料以百分比表示，采用χ2检验比较不同检测方法间阳性率，敏感性及特异性差异。P＜0.05时，差异有统计学意义。

2 结果

2.1 比较不同方法检测血清及脑脊液中AQP4－Ab阳性检出率

3种方法检测对照组血清中AQP4－Ab的表达阳性率均为0.0%。比较3种方法在NMO组与MS组患者血清及脑脊液中AQP4－Ab的阳性检出率，NMO组患者的阳性检出率有差异（P＝0.029，P＝0.001），其中，CBA对 AQP4－Ab的阳性检出率最高，分别为73.1%及85.1%。详见表2。

表2 不同方法检测血清及脑脊液中AQP4－Ab阳性检出率比较［例（%）］

2.2 比较不同方法检测血清及脑脊液中AQP4－Ab敏感性及特异性

比较3种方法的敏感性：CBA＞IIF＞ELISA；比较3种方法的特异性：CBA＞ELISA＞IIF。其中，3种方法的敏感性有差异（χ2＝7.115，P＝0.029；χ2＝14.443，P＝0.001），3种方法的特异性无差异。

3 讨论

视神经脊髓炎主要累及视神经与脊髓，是一种炎性脱髓鞘性疾病，其主要临床表现为亚急性发病的不同程度的视力障碍、双下肢瘫痪、感觉及二便障碍［7］，由于其与多发性硬化在临床症状上具有相似性，临床上对两者是否为同一疾病的不同亚型存在广泛的争议。近年来随着视神经脊髓炎病例报道的增多以及相关研究的进展［8－10］，视神经脊髓炎在临床经过、神经影像学、血清学、免疫病理学等方面均与多发性硬化表现不一致。视神经脊髓炎受累的脊髓节段比较长，MRI特点为病灶长度在3个或3个以上椎体节段，称之为纵向扩展性横贯性脊髓炎，与之不同的是，多发性硬化的病灶以大脑半球为主，脊髓病灶很少超过2个椎体.且多位于脊髓周边［11］。然而，由于视神经脊髓炎早期可出现脑部病灶，其与多发性硬化的预后有很大不同，因此，寻找能够帮助早期诊断、鉴别的生物学标志将有助于对患者的治疗。

AQP4－Ab又称视神经脊髓炎特异性抗体（nuromylitis optica－IgG，NMO－IgG）是 Lennon［12］等于2004年发现的，存在与视神经脊髓炎患者的血清及脑脊液中，对于早期诊断鉴别视神经脊髓炎与多发性硬化具有重要意义。AQP4是分布于中枢神经系统的高选择性的水跨膜转运通道蛋白，其主要表达于脑膜表面、室管膜和脑室周围，其他在下丘脑视上核、小脑、海马齿状回、中缰核、脉络丛上皮、视网膜及视神经也可有表达［13］，不同部位的AQP4发挥各自功能，共同参与脑脊液的分泌、分布与重吸收，此外，对于脑内渗透压、K＋的平衡及脑水肿的病理机制祈祷重要调节作用［14］。AQP4抗体能激活补体系统，引起中枢神经系统炎性脱髓鞘和坏死，诱导星型胶质细胞的损害［15］。

本次试验主要研究了组织间接免疫荧光检测、细胞免疫荧光法及酶联免疫吸附测定法这三种方法检测视神经脊髓炎患者血清及脑脊液中AQP4－Ab表达的临床应用。通过试验可以发现，3种方法中细胞免疫荧光法对AQP4－Ab的阳性检出率最高，分别为血清中73.1%及脑脊液中85.1%，与文献符合［16］，3 种方法的 敏感性比 较 为 CBA＞IIF＞ELISA，证明细胞免疫荧光法对AQP4－Ab的检出最有优势。此外，健康对照组血清中无一例检出AQP4－Ab，MS组患者血清及脑脊液中AQP4－Ab的阳性检出率无差异（P＞0.05），而NMO患者血清及脑脊液中 AQP4－Ab的阳性检出率有差异（P＝0.029，P＝0.001），均在一定程度上显示出 AQP4－Ab是NMO的特异性抗体，符合上述描写。

综上所述，细胞免疫荧光法检测神经脊髓炎患者的血清及脑脊液中水通道蛋白4抗体的阳性率、敏感性高，适于临床应用。

［1］麦卫华，胡学强，龙友明，等.水通道蛋白4启动子基因多态性与多发性硬化、视神经脊髓炎遗传易患性的关系［J］.中华神经科杂志，2012，45（5）：312.

［2］李世容，楚 兰.视神经脊髓炎与水通道蛋白4抗体及其检测方法的研究进展［J］.中华神经医学杂志，2011，10（1）：97.

［3］Sellner J，Boggild M，Clanet M，等.欧洲神经病学联盟关于视神经脊髓炎诊治的指南［J］.中国神经免疫学和神经病学杂志，2010，17（5）：383－385.

［4］张星虎.多发性硬化的诊断［J］.中国神经免疫学和神经病学杂志，2013，20（2）：79.

［5］徐 雁，任海涛，李文涵，等.不同基质的间接免疫荧光法同时检测血清和脑脊液水通道蛋白4抗体在视神经脊髓炎诊断中的应用［J］.中华神经科杂志，2014，47（10）：676.

［6］张大启，杨 丽，杨春生，等.水通道蛋白4抗体测定对视神经脊髓炎谱系疾病的意义［J］.中华神经医学杂志，2014，13（9）：914.

［7］Masaki K.Molecular pathology of multiple sclerosis and neuromyelitis optica［J］.Nihon Rinsho，2014，72（11）：1909.

［8］Kurosawa K，Fujihara K.Clinical concept，etiology and pathology of neuromyelitis optica［J］.Nihon Rinsho，2014，72（11）：1897.

［9］Tanaka K，Tanaka M.Pathogenesis of autoantibodies in demyelinating disorders of the central nervous system［J］.Nihon Rinsho，2014，72（11）：2067.

［10］EIOH，Dany F，EI MB，et al.Intractable hiccup and vomiting，neuropathic pruritus and tonic spasms in a case of neuromyelitis optica spectrum disorder［J］.Acta Neurol Belg，2015，79：562.

［11］Qi X，Sun C.Pay attention to the differences and similarities in the pathogenesis and management of multiple sclerosis and neuromyelitis optica［J］.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2014，94（39）：3041.

［12］Viswanathan S，Arip M，Mustafa N，et al.The frequency of antiaquaporin－4Ig g antibody in neuromyelitis optica and its spectrum disorders at a single tertiary referral center in malaysia［J］.Mult Scler Int，2014，201：568.

［13］Li Y，Schmidt－Edelkraut U，Poetz F，et al.GABAAR Regulates AQP4Expression in the Subependymal Zone：Relevance to Neural Precursors and Water Exchange［J］.J Biol Chem，2014，46：238.

［14］Nakatsuji Y.Blood and cerebrospinal fluid biomarkers in MS/NMO［J］.Nihon Rinsho，2014，72（11）：1970.

［15］武 雷，黄德晖，吴卫平，等.水通道蛋白4抗体在视神经脊髓炎发病机制中的作用［J］.中国神经免疫学和神经病学杂志，2011，18（6）：431.

［16］叶 静，廖张元，孙 慧，等.视神经脊髓炎特异性抗体三种检测方法比较［J］.中华内科杂志，2011，50（10）：848.