MK－2206阻断PI3K/AKT通路对骨肉瘤细胞MG63增殖及侵袭性的影响

何德喜，童 岚，何汝畅，李晓琴，潘海峰，靳 阳

（1.成武县人民医院，山东 成武274200；2.吉林大学第一医院，吉林 长春130021；3.济宁医学院附属医院，山东 济宁272000；4.一汽总医院，吉林 长春130011；5.济宁市第一人民医院，山东 济宁272011）

骨肉瘤（Osteosarcoma）也称成骨肉瘤，是常见的骨原发性恶性肿瘤，具有恶性程度高、侵袭性强、易复发转移等特点［1］。随着新辅助化疗、手术、术后化疗的开展，骨肉瘤5年生存率提高到近80%，但仍有半数以上的患者死于骨肉瘤的转移和复发［2］。有效控制骨肉瘤细胞的转移对延长患者生存期有着深远意义。

PI3K/AKT细胞信号转导通路在肿瘤的发生、增殖、迁移、耐药等生物过程中发挥着重要作用。AKT是PI3K下游的靶蛋白，是信号转导途径中的关键蛋白激酶，在多种肿瘤中如卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌和口腔鳞癌等肿瘤细胞中呈过表达［3］。活化的Akt通过影响下游多种效应分子的活化状态而发挥作用。因此AKT成为研究肿瘤生物学行为的重要靶点，MK－2206是一种强效的，高特异性及非ATP竞争结合的Akt变构抑制剂［4］，本研究以骨肉瘤细胞 MG63为实验材料，检测MK－2206对骨肉瘤细胞增殖及侵袭能力的影响，为骨肉瘤的药物治疗提供新的理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞培养 人骨肉瘤细胞株MG－63购自上海中科院细胞库，生长于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养，待细胞长至体积比约90%时，进行后续试验。

1.1.2 主 要 试 剂 MK－2206 购 自 美 国 Selleck Chemicals公司；RT－PCR 反应试剂盒和 DNA Marker购自日本Takara公司；蛋白提取试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；鼠抗β－actin、兔抗p－Akt、兔抗 MMP9、兔抗 TIMP、兔抗 VEGF多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；HRP标记的山羊抗兔或小鼠IgG购自北京博奥森公司。

1.1.3 分组 未经处理的细胞为空白对照组、加入等量DMSO的细胞为溶媒对照组，加入 MK－2206的细胞为实验组。

1.2 方法

1.2.1 MTT法测定细胞增殖抑制率 取对数生长期细胞，制备浓度为4×105/L的细胞悬液，接种于无菌96孔培养板，每孔200μl，于37℃、5%CO2饱和湿度孵育箱中培养12h。实验组分别给予1、2.5、5、10、20μM/L的 MK－2206。每组的每个浓度下设6个复孔，培养24h后，每孔加入20μl的噻唑蓝（MTT 5g/L）。孵育4h后，吸弃各孔培养液，每孔加入DMSO150μl。微振荡10min后，于酶标仪波长490nm处测吸光度（A）值。以上各组实验重复6次。细胞增殖抑制率（%）＝（1－实验组A值/对照组A值）×100%。

1.2.2 RT－PCR法检测 mRNA 取处于对数生长期的细胞按2×106/孔的细胞数接种于6孔板内，实验组给予10μM/L的 MK－2206，培养24h。Trizol裂解各组MG63细胞提取总RNA，半定量RTPCR法检测各组细胞中的CyclinD1、CDk4、VEGF、内参照GAPDH，引物见表1。

1.2.3 Western Blot法检测蛋白表达 将各组细胞用冷PBS冲洗3次，吸净PBS液体。在培养瓶中加入400μl蛋白裂解液及4μl苯甲基磺酰氟（PMSF）提取蛋白，喹啉二甲酸二钠（BCA）法蛋白定量。加入上样缓冲液，十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶（SDS－PAGE）电泳，每孔蛋白含量约为30 μg。将蛋白转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜，丽春红染色，含5% 脱脂奶粉的Tris盐酸缓冲液（TBST）4℃封闭过夜。在PVDF膜上加入1∶250稀释的兔抗p－Akt、MMP9、VEGF抗体，1∶500兔抗β－actin杂交2h，PBS洗膜；加入1∶1 000稀释的羊抗兔二抗，37℃ 孵育2h，增强化学发光法（ECL）显色。观察各条带深浅变化并加以分析，β－actin作内参照。测量条带灰度值，与β－actin比值作为蛋白相对表达量。

表1 引物序列表

1.3 统计学处理

数据以均数± 标准差（mean±SD）表示，采用SPSS 13.0统计软件分析。组间均数比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MK－2206对骨肉瘤细胞MG63增殖的影响

MTT法检测结果显示骨肉瘤细胞MG63在不同浓度MK－2206作用24h后，细胞增值率均受到了抑制。1，2.5，5，10，20μM/L浓度时均明显抑制了骨肉瘤细胞MG63的增殖，抑制率分别为7.98±4.24%，15.07±3.55%，29.36±3.15%，47.78±3.94%，65.32±3.25%，P＜0.05，并且呈剂量依赖性（见图1）。10μM/L MK－2206组的增殖抑制率最接近IC50，后续实验选用10μM/L浓度。

图1 MK－2206抑制了骨肉瘤细胞MG63的增殖

2.2 MK－2206有效阻断了Akt的磷酸化

10μM/L MK－2206 作 用 MG63 细 胞 24h，Western－blot法检测各组细胞中的p－Akt，实验组中的p－Akt水平较对照组明显降低，测得灰度值MK－2206组0.45±0.05，P＜0.01。

图2 MK－2206阻断AKT磷酸化

2.3 RT－PCR法检测增殖相关基因的表达

RT－PCR结果显示 MK－2206可以抑制 MG63细胞内增殖相关基因CD1、CDK4的表达，同时下调了 VEGF的表达。MK－2206组CyclinD1mRNA 0.87±0.05，P＜0.01；CDk4mRNA 1.04±0.04，P＜0.01和 VEGF mRNA 0.96±0.01，P＜0.01表达量显著降低。

图3 MK－2206对骨肉瘤细胞MG63增殖相关基因的影响

2.4 Western Blot法检测侵袭相关基因的表达

Western Blot结果显示实验组细胞中侵袭相关基因 MMP9表达下降，VEGF表达也下降，MMP9 0.57±0.05，VEGF 0.81±0.06，P＜0.01，说明了MK－2206对骨肉瘤细胞有抑制侵袭的作用。

图4 MK－2206抑制骨肉瘤细胞MG63侵袭

3 讨论

骨肉瘤好发于青少年，发病率居原发骨恶性肿瘤的第1位，在截肢术作为主要治疗方案的年代，其5年生存率不及20%，预后极差。随着手术操作技术的提高、术前术后放化疗、新化疗药物的研发、新辅助化疗联合保肢治疗的发展，不仅使患者避免了截肢带来的残疾，而且将5年生存率提高到80%，明显延长了骨肉瘤的生存期［5］。肿瘤复发和转移仍然是骨肉瘤患者死亡的主要原因，有效抑制肿瘤侵袭对防治骨肉瘤复发、转移、改善预后具有重要意义。

PI3K/AKT细胞信号转达通路在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用，PI3K通过磷酸化激活AKT调控下游基因，诱导系列级联反应对肿瘤的增殖、凋亡、迁移、侵袭、耐药等生物过程发挥重要作用［3］。AKT是PI3K/AKT通路的关键靶点，本实验采用高选择性AKT抑制剂MK－2206阻断AKT磷酸化激活，研究骨肉瘤细胞GM63增殖及侵袭能力的变化。Western blot结果表明 MK－2206可以有效阻断AKT的磷酸化，并且通过MTT实验发现，MK－2206抑制骨肉瘤细胞 MG63的增殖，随着MK－2206的浓度升高，抑制作用愈加明显，具有剂量依赖特点。细胞周期蛋白CyclinD1是细胞周期调节因子之一，CyclinD1表达增高意味着肿瘤细胞增值能力增强，其可阻断相应的CDks，消除Rb蛋白对细胞周期的阻滞作用［6］。本实验通过RT－PCR检测到MK－2206组细胞的CyclinD1、CDk4表达降低，说明骨肉瘤细胞MG63增殖能力下降。血管内皮生长因子VEGF诱导肿瘤内新生血管形成，提供肿瘤细胞生长需要的营养［7，8］。同时VEGF还具有增强血管内皮通透性的作用，促进肿瘤细胞侵袭。本研究分别检测骨肉瘤细胞MG63中VEGF mRNA和蛋白水平的变化，实验组表现出了VEGF表达的明显减少，说明MK－2206对骨肉瘤细胞的增殖和侵袭能力起到了抑制作用。Western blot还检测到实验组MG63细胞中金属基质蛋白酶MMP9的下调表达。MMP9是肿瘤细胞分解破坏基底膜的主要蛋白酶之一，在肿瘤细胞的侵袭过程中发挥着关键作用，MMP9的下调表达说明肿瘤细胞侵袭能力的降低。

综上所述，AKT抑制剂 MK－2206通过阻断AKT磷酸化阻断了PI3K/AKT细胞通路对MG63骨肉瘤细胞的影响，下调表达了增殖相关基因CyclinD1、CDk4、VEGF和侵袭相关基因 MMP9，说明MK－2206可以有效抑制骨肉瘤细胞 MG63的增殖和侵袭能力，为骨肉瘤的新辅助化疗提供了新的理论依据。

［1］L Mirabello，RJ Troisi，and S A Savage.Osteosarcoma incidence and survival rates from 1973to 2004：data from the surveillance，epidemiology，and end results program［J］.Cancer，2009，115（7）：1531.

［2］NM Bernthal，N Federman，FR Eilber，et al.Long－term results（＞25years）of a randomized，prospective clinical trial evaluating chemotherapy in patients with high－grade，operable osteosarcoma［J］.Cancer，2012，118（23）：5888.

［3］Liu P，Cheng H，Roberts TM，et al.Targeting the phosphoinositide 3－kinase pathway in cancer［J］.Nat Rev Drug Discov，2009，8：627.

［4］Ae－Ran Choi，Ju－Hwa Kim，and Sungpil Yoon.Sensitization of Cancer Cells through Reduction of Total Akt and Downregulation of Salinomycin－Induced pAkt，pGSk，pTSC2，and p4EBP1by Cotreatment with MK－2206［J］.BioMed Research International，2013，14（9）：17304.

［5］Ottaviani G，Jaffe N.The epidemiology of osteosarcoma［J］.Cancer Treat Res，2009，152：3.

［6］Lukas J，Bartbova J，Rohde M，et al.Cyclin D1is dispensable for G1control in retinoblastoma gene－deficient cells independently of cdk4activity［J］.Mol Cell Biol，1995，15（5）：2600.

［7］Peters KG，De VC，Williams LT.Vascular endothelial growth factor receptor expression during embryogenesis and tissue repair suggests a role in endothelial differentiation and blood vessel growth［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1993，90：8915.

［8］Millauer B，Wizigmann VS，Schnurch H，et al.High affinity VEGF banding and developmental expression suggest flk－las a major regulator of vasculogenesis and angiogenesis［J］.Cell，1993，72：835.