UPLC-MS/MS法测定苦楝皮、川楝子及其制品中川楝素含量

郝刚，王亚琼，俞蕴莉，朱佳慧

(1.苏州市食品药品检验所，江苏 苏州 215104；2.苏州大学 附属第二医院，江苏 苏州 215004；3.苏州大学，江苏 苏州 215123)

·基础研究·

UPLC-MS/MS法测定苦楝皮、川楝子及其制品中川楝素含量

郝刚1*，王亚琼1，俞蕴莉2，朱佳慧3

(1.苏州市食品药品检验所，江苏 苏州215104；2.苏州大学 附属第二医院，江苏 苏州215004；3.苏州大学，江苏 苏州215123)

目的：基于UPLC-MS/MS方法建立苦楝皮、川楝子、炒川楝子中川楝素的定性鉴别及含量测定方法。方法：供试样品经甲醇加热回流后，采用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)，以BEH-C18为分析柱，流动相为0.1%甲酸水-乙腈(60∶40)，电喷雾电离(ESI-)，采用一级、二级扫描及多重反应监测(MRM)模式，对川楝子、炒川楝子、苦楝皮中川楝素进行快速定性定量检测。结果：所建方法能快速定性、定量检测川楝素，定性离子对为m/z573→531和m/z573→425，川楝素在50～1000ng·mL-1线性良好，平均加样回收率为97.6%，方法检出限为60μg·g-1。结论：所建方法快速、灵敏，适用于川楝子、炒川楝子、苦楝皮中川楝素的快速定性鉴别及含量测定。

川楝素；超高效液相色谱-串联质谱法；定性定量分析

川楝素(Isotoosendanin)是从楝属植物的根茎及川楝果实中提取的一种三萜化合物，其结构式如图1所示。传统中医药理论认为川楝素具有杀虫、驱蛔等作用，近年来研究表明，川楝素还具有抑制离子通道、抑制呼吸中枢、抗肿瘤等多种生物活性[1-3]。由于川楝素具有生物毒性，《中华人民共和国药典》(2010年版)对川楝素的含量做了严格规定：川楝子中含川楝素为0.06%～0.20%；炒川楝子中含川楝素为0.04%～0.20%；苦楝皮中含川楝素为0.01%～0.20%[4]。目前文献报道多采用HPLC-UV法、LC-MS法对川楝素进行含量测定，但这些方法分析时间长、灵敏度低、且不能提供定性依据[5-7]，本实验基于UPLC-MS/MS法对川楝子、炒川楝子、苦楝皮中川楝素进行快速定性、定量分析。

图1 川楝素(Isotoosendanin)化学结构式

1 材料

1.1仪器

ACQUITYUPLCXevoTQ-S三重四级杆液质联用仪(美国Waters公司)；电喷雾离子源(ESI)，Masslynx4.1数据处理系统(Waters)；Thermo低温离心机；KQ-300DA型数控型超声波清洗器；MILLIPORE纯水仪。

1.2样品与试剂

川楝素对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111842-201102，纯度：94.5%)；实验用水为超纯水，其他试剂均为色谱纯。

川楝子(批号：14081502)、炒川楝子(批号：13050201)、苦楝皮(批号：12121604)购于吴江上海蔡同德堂中药饮片有限公司，并由苏州市食品药品检验所吴银生(主任中药师)鉴定均为楝科植物川楝MeliatoosendanSieb.et Zucc的干燥成熟果实。由苏州市食品药品检验所王亚琼主管中药师按 《中华人民共和国药典》(2010版)鉴别项对上述3种中药予以鉴定[4]，结果均符合《中华人民共和国药典》规定。

2 方法与结果

2.1UPLC色谱条件

色谱柱：BEH-C18色谱柱(2.1mm×50mm，1.7μm)；流动相：0.1%甲酸水溶液-乙腈(60∶40)；柱温：30℃；进样器温度：15℃；流速：0.3mL·min-1；进样量：1μL。

2.2质谱条件

电喷雾离子源(ESI)；负离子扫描；毛细管电压3.0kV；脱溶剂气温度：400℃；脱溶剂气体流量：600L·h-1；锥孔气流量：150L·h-1；碰撞气体为氩气；采用一级扫描、二级扫描及多反应检测模式(MRM)监测。

2.3对照品储备液制备

精密称取川楝素对照品10mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液(1mg·mL-1)。

2.4样品溶液制备

取样品粉末0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，加热回流1h，冷却，用甲醇补足减失的重量，取1mL样品溶液，用甲醇稀释100倍，再取1mL溶液，12000r·min-1离心5min，取上清液进样分析。

2.5质谱方法

将川楝素对照品储备液用甲醇稀释成100ng·mL-1的对照品溶液，采用ESI-离子化模式，直接进样法优化质谱条件。川楝素分子量为574，本实验采用一级质谱扫描测得川楝素准分子离子峰[M-H]-为m/z573(见图2)。DaughterScan扫描模式测得川楝素的主要二级碎片离子为m/z531和425(见图3)，采用这两个特征碎片离子作为川楝素定性依据，并建立多重反应监测(MRM)定量方法，川楝素对照品溶液TIC图如图4所示，由于川楝素存在互变异构体异川楝素，故TIC图出现双峰[8-9]，保留时间分别为1.01min和1.16min。

图2 川楝素对照品溶液一级扫描图

图3 川楝素对照品溶液二级扫描图

图4 川楝素对照品溶液TIC图

2.6线性范围

对照品储备液用甲醇逐级稀释成质量浓度分别为1000、500、250、100、50ng·mL-1的标准对照品溶液，取1μL进样分析，以TIC图两峰面积总和为纵坐标(Y)，各对照品质量浓度为横坐标(X)，进行线性回归，得回归方程为：Y=464.6X+142.8，r=0.9995，川楝素质量浓度在50～1000ng·mL-1与峰面积呈良好的线性关系。

2.7检出限与定量限

仪器检出限与定量限：用甲醇稀释成质量浓度为3ng·mL-1和10ng·mL-1的川楝素对照品溶液，进样分析，3ng·mL-1的川楝素对照品溶液TIC图以小峰计，信噪比为7.67，该浓度作为仪器检出限(S/N>3)(见图5A)。10ng·mL-1的川楝素对照品溶液TIC图以小峰计，信噪比为17.84，该浓度作为仪器定量限(S/N>10)(见图5B)。

注：A.检出限；B.定量限。图5 川楝素检出限和定量限结果

方法检出限与定量限：根据样品溶液制备方法，样品实际稀释倍数为5000，计算该方法下川楝素检出限为60μg·g-1，方法定量限为200μg·g-1。

2.8精密度试验

取100ng·mL-1的川楝素对照品溶液分别进样6次，记录TIC图峰面积，结果川楝素两峰面积之和RSD=1.5%(n=6)，表明精密度良好。

2.9稳定性试验

取0.25g川楝子样品，按2.4项下方法进行样品前处理，按2.1和2.2测定，分别于0、1、2、4、8、12、24h测定峰面积。结果川楝素两峰面积之和的RSD=2.07%，表明样品在24h内稳定。

2.10加样回收率试验

称取已知含量的川楝子供试品0.125g，精密称定，分别精密加入一定量的川楝素对照品溶液，按样品溶液制备方法进行样品前处理，按2.1和2.2条件测定回收率，结果见表1。

表1 川楝素回收率试验

2.11样品测定

取川楝子、炒川楝子、苦楝皮各5份，按样品溶液制备方法进行样品前处理，按2.1和2.2条件测定，3种中药质谱图均出现m/z573→531和m/z573→425两个特征离子对，证实3种中药均含有川楝素。以川楝素两个峰面积之和定量，代入线性回归方程，计算各药中川楝素含量，结果川楝子供试品中川楝素含量为0.16%；炒川楝子供试品中川楝素含量为0.17%，苦楝皮供试品中川楝素含量为0.17%，均符合《中华人民共和国药典》(2010年版)的含量规定[4]。

3 讨论

液质联用技术以其高效、快速、灵敏的特点已广泛应用于各类检测领域，尤其针对中药来源广泛、成分复杂、分离困难等特点更具有独特优势，并越来越多地应用于中药成分分析与质量控制[10]。《中华人民共和国药典》(2010年版)采用HPLC-MS法对川楝子、苦楝皮等药材中的川楝素进行含量测定，并基于川楝素的生物毒性，对这类中药中川楝素的含量做了严格规定。《中华人民共和国药典》方法采用普通HPLC和单四级杆检测器进行定量，该方法分析时间长，灵敏度低，且无法提供川楝素的化学结构信息，不能用于川楝素的定性鉴别[4]。本实验基于UPLC-MS/MS法，通过一级、二级质谱扫描确立了川楝素的两个特征离子对：m/z573→531和m/z573→425，其中m/z531是川楝素在负离子条件下通过丢失乙酰基团形成的碎片离子[M-CH3CO]-，而m/z425可能是川楝素丢失CH3CO、H2O、CO等多个基团后形成的碎片离子[M-2CH3CO-CO-2H2O]-。将上述两个离子对用于中药中川楝素的定性鉴别，并进一步通过MRM模式，建立了川楝素的定量检测方法，方法学验证表明，所建方法专属性强、稳定性好、灵敏度高、分析时间短，用于川楝子、苦楝皮、炒川楝子中川楝素的定性鉴别及含量测定，方法快速、准确。本研究为川楝子、苦楝皮等中药中川楝素的质量控制提供了实验依据。

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DeterminationofToosendaninwithUPLC-MS/MS

HAOGang1*，WANGYaqiong1，YUYunli2，ZHUJiahui

(1.SuzhouInstituteforFoodandDrugControl，Suzhou215104，China；2.TheSecondAffiliatedHospitalofSoochowUniversity，Suzhou215004，China；3.SoochowUniversity，Suzhou215123，China)

Objective：To develop a specific，sensitive and rapid UPLC-MS/MS method for qualitative and quantitative analysis of toosendanin.Methods：Samples were heated with methanol under reflux and further detected by the ultra performance liquid chromatography-electrospray ion(ESI-)trap mass spectrometry method. The separation was performed on Waters UPLC using BEH-C18column with a isocratic elution(0.1% acetic acid∶methanol=60∶40).The qualitative and quantitative analysis of toosendanin was conducted in the MS scan，Daughter scan and MRM mode by UPLC-MS/MS.Results：Them/z573→531m/z573→425were two qualitative ion pairs of toosendanin. The calibration curves showed good linear relationship in the range of50～1000ng·mL-1for the component.The determination limits was60μg·g-1，and the average recovery rate was97.6%.Conclusion：The method was proved to be specific，rapid and sensitive，which can be used to qualitative and quantitative analysis of toosendanin

Toosendanin；UPLC-MS/MS；qualitative and quantitative

*

郝刚，主管药师，博士，研究方向：食品药品质量与安全监控；Tel：(0512)67079940，E-mail：haogang531@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.12.012

2015-03-19)