响应曲面法优化新疆阿魏种子总倍半萜香豆素提取工艺△

李广志，王钧篪，李晓瑾，曹丽，吕娜，沈连刚，朱军，陈刚，斯建勇*

(1.中国医学科学院 北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193；2.新疆维吾尔自治区中药民族药研究所，新疆 乌鲁木齐 830002)

·中药工业·

响应曲面法优化新疆阿魏种子总倍半萜香豆素提取工艺△

李广志，王钧篪1，李晓瑾2，曹丽1，吕娜1，沈连刚1，朱军2，陈刚2，斯建勇1*

(1.中国医学科学院 北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193；2.新疆维吾尔自治区中药民族药研究所，新疆 乌鲁木齐 830002)

目的：优化新疆阿魏种子中总倍半萜香豆素的提取工艺。方法：以乙醇体积分数、料液比、提取时间为自变量，在单因素试验的基础上，应用Box-Behnken 中心组合设计建立数学模型，以总倍半萜香豆素提取率为响应值，进行响应面分析。结果：最佳提取工艺条件为80%乙醇加热回流提取40 min，料液比为1∶40。总倍半萜香豆素提取率预测值为6.60%，实际值为6.62%，相对误差为0.3%。结论：该优选工艺稳定可靠，为新疆阿魏资源的合理利用提供参考。

新疆阿魏；总倍半萜香豆素；响应曲面分析法

新疆阿魏为伞形科阿魏属植物，主要分布在我国新疆乌鲁木齐地区。倍半萜香豆素为阿魏属植物特征类型化合物，在新疆阿魏的化学成分研究中也发现了多种倍半萜香豆素化合物。现代药理学研究发现，该类型化合物具有抗炎、抑菌、抗肿瘤、艾滋病病毒(HIV)抑制作用等多种生物活性[1-2]。目前有关总倍半萜香豆素提取工艺的研究还未见报道。本试验在探讨了各因素对提取率影响的基础上，通过响应曲面分析法对新疆阿魏种子中总倍半萜香豆素的提取工艺进行研究，优选出易操作、高得率、低成本的工艺技术，为倍半萜香豆素类化合物的研究开发提供试验数据。

1 仪器与材料

1.1仪器

UV-2102型紫外-可见分光光度计(尤尼科上海仪器有限公司)；NewClassic电子天平(梅特勒-托利多上海仪器有限公司)。

1.2材料

所用药材于2014年7月采自新疆伊犁，经新疆中药民族药研究所李晓瑾研究员鉴定为新疆阿魏FerulasinkiangensisK.M.Shen的种子，标本存放于新疆中药民族药研究所。Lehmannolone 对照品为本课题组分离纯化，经核磁数据进行结构鉴定。试验中用到的试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1供试品溶液的制备

精密称取干燥的新疆阿魏种子粗粉1.0g，置250mL圆底烧瓶中，加80%乙醇40mL，回流提取40min，趁热减压抽滤，合并滤液，用提取液定容至100mL，充分摇匀后取1mL溶液，置50mL容量瓶定容至刻度，即得。

2.2对照品溶液的制备

精密称取Lehmannolone对照品11mg，置于50mL容量瓶中，加甲醇适量，超声加热，使其全部溶解。放冷，加甲醇定容至刻度，摇匀即得。

2.3检测波长的确定

以甲醇为空白液，对对照品溶液进行全波长扫描，扫描结果与文献报道[3]结果一致，在323nm处该类化合物有最大特征吸收。故本试验选此波长为该类化合物的检测波长。

2.4绘制标准曲线

精密量取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mLLehmannolone对照品溶液，分别置于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。摇匀后分别移取不同体积的溶液至5mL容量瓶，甲醇定容。充分摇匀后，以甲醇为空白对照，于323nm处测定吸光度(A)。以吸光度为纵坐标，质量浓度为横坐标，得回归方程Y=0.0428X-0.0042(r=0.9991)，表明Lehmannolone质量浓度在8.8～44mg·L-1与吸光度线性关系良好。

2.5样品测定

精密量取适量供试品溶液，以相应的提取液为空白对照，按2.3项下方法测定A，计算总倍半萜香豆素含量。

新疆阿魏种子中总倍半萜香豆素提取率=种子中总倍半萜香豆素提取质量/种子干重×100%=[(A+0.004 2)×5000/0.042 8]×100%

2.6单因素试验考察

2.6.1乙醇体积分数考察 精密称取新疆阿魏干燥种子1.0g，按2.1项下方法进行提取，按2.5项下方法进行测定。其他条件固定不变，乙醇体积分数分别为70%、75%、80%、85%、90%、100%，结果总倍半萜香豆素的提取率依次为5.27%、7.19%、7.72%、7.53%、4.78%、3.13%，因此乙醇体积分数以80%为宜。

2.6.2 料液比考察 精密称取新疆阿魏干燥种子1.0g，按2.1项下方法进行提取，按2.5项下方法进行测定。其他条件固定不变，分别加10、20、30、40、50倍量80%乙醇，结果总倍半萜香豆素的提取率依次为5.01%、7.20%、8.31%、6.80%、6.10%，故选择加30倍量80%乙醇。

2.6.3 提取时间考察 精密称取新疆阿魏干燥种子1.0g，其他条件固定不变，分别按2.1项下方法提取20、30、40、50、60min，按2.5项下方法进行测定，结果总倍半萜香豆素的提取率依次为6.30%、6.32%、6.33%、6.86%、6.48%，故选择提取50min。

2.7响应曲面分析法优化工艺

根据Box-Behnken中心组合试验设计原理[4-5]，选择乙醇体积分数(A)、料液比(B)和提取时间(C)为考察因素，在单因素试验基础上，采用3因素3水平的响应面分析法。见表1。选用Design-Expert8.0.6试验设计，以总黄酮提取率为响应值进行响应面分析。试验安排及结果见表2。

表1 新疆阿魏种子中总倍半萜香豆素提取工艺响应面试验因素水平表

表2 新疆阿魏种子中总倍半萜香豆素的提取工艺Box-Behnken中心组合试验安排

利用Design-Expert 8.0.6软件对表2试验数据进行多元回归拟合，得出回归方程中的各项系数，见表3。用F检验检验显著性[6-7]。

表3 回归方程系数及显著性检验

由表3可知，各因素对新疆阿魏种子总倍半萜香豆素的提取工艺影响顺序：乙醇体积分数>料液比>提取时间。A、A2、B2、AB、BC的F检验均很显著，说明各个试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系，而存在交互作用的二次关系。得出总倍半萜香豆素提取率的回归方程：Y=6.77-0.71A+0.039B+0.016C-0.18AB+0.06AC-0.13BC-1.68A2-0.24B2-0.074C2。响应面回归方程的F检验均很显著；模型的校正决定系数(Adj R-Squared)=0.992 9，说明该模型几乎可以解释全部响应值变化；失拟项的F=18.42，P=0.183>0.05，差异不具有统计学意义，表明可用二次回归方程模型代替试验点对试验数据进行分析，见图1～3。

由图1可知，总倍半萜香豆素的提取率随着乙醇体积分数和料液比的增加先增大后变小。图2表明，随着乙醇体积分数和提取时间的增加，总倍半萜香豆素提取率先增加后下降。图3表明，提取时间和料液比对总倍半萜香豆素提取率的影响不显著。综上所述，新疆阿魏种子中总倍半萜香豆素最佳提取工艺条件：80%乙醇，料液比为1∶40，提取时间为40 min，此条件下总倍半萜香豆素的提取率为6.60%。

2.8精密度试验

精密量取Lehmannolone对照品溶液2mL，共6份，分别置于10mL容量瓶中，按2.5方法进行，RSD为0.98%，说明该方法精密度良好。

2.9验证试验

按最佳提取条件进行6次重复试验进行验证，计算总倍半萜香豆素提取率分别为6.67%、6.65%、6.54%、6.57%、6.59%、6.69%，RSD为0.92%，说明该提取工艺稳定可行。

2.10准确度试验

在已知含量的6份新疆阿魏种子总倍半萜香豆素提取液中各加入Lehmannolone对照品溶液2mL(0.22g·L-1)，按2.5方法进行测定，计算得平均回收率为100.09%，RSD为1.13%，表明该方法测定总倍半萜香豆素含量是可行的。

图1 乙醇体积分数与料液比对新疆阿魏种子中总倍半萜香豆素提取的影响等高线及响应面

图2 乙醇体积分数与提取时间对新疆阿魏种子中总倍半萜香豆素提取的影响等高线及影响

图3 料液比与提取时间对新疆阿魏种子中总倍半萜香豆素提取的影响等高线及响应面

2.11稳定性试验

称取新疆阿魏种子1.0g，按2.1方法处理。对提取液分别在0.5、1、3、6、12、24h后按2.5方法进行测定。结果显示吸光度在24h内无明显变化，RSD为1.25%，表明新疆阿魏种子中总倍半萜香豆素成分在24h内稳定性良好。

3 讨论

通过前期对新疆阿魏种子化学成分的系统研究，发现半萜香豆素类成分为其主要的特征化合物。本试验对新疆阿魏种子总倍半萜香豆素的提取工艺进行优选，为深入开发新疆阿魏总倍半萜香豆素提取物奠定基础。目前工艺优选常采用正交设计，但存在精度不够，建立的数学模型预测性较差等缺陷。本试验根据Box-Behnken中心组合设计[8]，以新疆阿魏种子为原料，建立了乙醇体积分数、料液比、提取时间对新疆阿魏种子中总倍半萜香豆素提取率的回归模型，并对模型进行失拟以及F检验和t检验。结果表明，可用二次回归方程模型代替试验点对试验结果进行分析。

[1] 王月娥，斯建勇，李晓瑾，等.新疆阿魏种子化学成分的研究(I)[J].中国现代中药，2011，13(1)：26.

[2] Guangzhi Li，Xiaojin Li，Li Cao，et al.Steroidal esters fromFerulasinkiangensis[J].Fitoterapia，2014，97：247.

[3] Mohamed H，Abd EI-Razek，Shinji Ohta，et al.Sesquiterpene coumarins from the roots of Ferula assa-foetida [J].Phytochemistry，2001，58：1289.

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[5] BOX G E P，Hunter W G.Statistics for experiments：An introduction to design，data analysis，and model building [M].New York：Wiley，1990.

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[7] 徐中儒.回归分析与试验设计 [M].北京：中国农业出版社，1998.

[8] 陈诗强，林江萧，陈剑锋.相应曲面分析法优化油茶籽中总黄酮提取工艺[J].中国实验方剂学杂志，2013，19(8)：26.

OptimizaionofExtractionTechnologyofTotalSesquiterpeneCoumarinsfromSeedsofFerulasinkiangensisbyResponseSurfaceMethod

LIGuangzhi1，WANGJunchi1，LIXiaojin2，CAOLi1，LYUNa1，SHENLiangang1，ZHUJun2，CHENGang2，SIJianyong1*

(1.InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciences，PekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China；2.XinjiangInstituteofChineseMateriaMedicaandEthicalMateriaMedica，Urumqi830002，China)

Objective：To optimize extraction technology of total sesquiterpene coumarins from the seeds ofFerulasinkiangensis.Method：With ethanol concentration，solid-liquid ratio and extraction time as independent variables，and on the basis of single-factor tests，Box-Behnken central composite design was used to establish mathematical method，the yield of total sesquiterpene coumarins was used as response value，response surface methodology was adopted to the analysis of response surface method.Result：Optimum extraction technology conditions were as follows：ethanol concentration 80%，solid-liquid ratio of 1∶40，extraction time 40 min.The predicted extraction yield of total sesquiterpene coumarins was 6.60%，and the verification 6.62%，with relative error of 0.3%.Conclusion：This optimized technology was reliable and stable，and it could provide reference for rational utilization of resources ofFerulasinkiangensis.

Ferulasinkiangensis；total sesquiterpene coumarins；Response Surface Methodology

国家自然科学基金面上项目(81460661，81460586)；国家“重大新药创制”科技重大专项(2012ZX09301-002-001，2011ZX09307-002-01)

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斯建勇，研究员，研究方向：天然药物化学；Tel：(010)57833299，Email：jianyongsi@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.12.021

2015-04-25)