响应曲面法优化银杏叶提取物柱层析精制工艺△

冯玉康，王文鹏，郝鹏彬，蔡向杰，赵玉欣，孙胜斌，姜国志

(1.神威药业集团有限公司，河北 石家庄 051430；2.河北省中药注射液工程技术研究中心，河北 石家庄 051430；3.中药注射剂新药技术开发国家地方联合工程实验室，河北 石家庄 051430)

·中药工业·

响应曲面法优化银杏叶提取物柱层析精制工艺△

冯玉康1*，王文鹏1，郝鹏彬1，蔡向杰1，赵玉欣1，孙胜斌2，姜国志3

(1.神威药业集团有限公司，河北 石家庄 051430；2.河北省中药注射液工程技术研究中心，河北 石家庄 051430；3.中药注射剂新药技术开发国家地方联合工程实验室，河北 石家庄 051430)

目的：利用响应曲面法优化银杏叶提取物柱层析精制工艺，从而得到较高含量的银杏叶提取物。方法：在单因素试验的基础上，应用Box-Behnken设计方法建立数学模型，选择低浓度醇浓度、高浓度醇浓度和上柱溶液pH值为影响因子，以总黄酮含量和内酯含量为响应值进行响应曲面分析。结果：银杏叶提取物最佳柱层析精制工艺条件：低浓度醇浓度为18%，高浓度醇浓度为67%，上柱溶液pH值为5.8。在最佳精制工艺条件下银杏叶提取物的总黄酮的平均含量为29.50%，内酯平均含量为10.58%。结论：利用响应曲面法优化银杏叶提取物柱层析精制工艺是稳定可行的，可为工业化大生产提供参考。

响应曲面法；银杏叶提取物；柱层析

银杏系银杏科植物，是中国特有的起源久远的珍稀树种之一，属国家一级保护植物[1]。其性平，味甘、苦、涩，归心、肺经，具有活血化瘀、通络止痛、敛肺平喘、化浊降脂等功能。用于瘀血阻络、胸痹心痛、中风偏瘫、肺虚咳喘、高脂血症[2]。银杏叶含有多种化学成分，药用价值主要体现在总黄酮类和内酯类化合物。内酯类化合物主要包括倍半萜类白果内酯、二萜类银杏内酯A、B、C、J和M；银杏叶中含有38种黄酮类化合物，其中主要分为双黄酮[3]、黄苷元和黄酮苷，黄酮苷主要是槲皮素、山柰素、异鼠李素糖苷和儿茶素类[4-6]。《中华人民共和国药典》2010版规定银杏总黄酮醇苷含量不得少于24.0%，萜类内酯含量不得少于6.0%。

目前银杏叶提取物的提取方法包括水提取法、有机溶剂提取物法、超声提取法[7]、超临界提取法[8]、微波提取法[9]和酶提取法[10]。其中使用最广泛的为有机溶剂提取法，所以本研究提取部分采用的是稀乙醇提取法。在对银杏叶提取物进行精制时，胡敏等[11]通过比较研究发现，树脂法优于溶剂萃取法。另外由于树脂成本低、回收率高、有机溶剂残留少等优点，目前国内均采用树脂吸附法精制银杏叶提取物。本研究就是利用响应曲面优化法对柱层析的工艺进行优化，完成银杏叶提取物的精制，为舒血宁注射液的生产提供合格的原料。

1 仪器与试药

1.1仪器

梅特勒托利多METTLER-ALC-210.4电子分析天平；美国戴安UltiMate3000高效液相色谱仪；科伟HH-SB型电热恒温水浴锅；昆山禾创KH3200E型超声清洗器；无锡申科R501B型旋转蒸发器。

1.2试药

槲皮素、山柰素、异鼠李素、银杏内酯A、白果内酯、银杏内酯B、银杏内酯C(中国食品药品检定研究院，批号分别为100081-200907，110861-201310，110860-201109，110862-201310，110865-201306，110863-201209，110864-201307)；甲醇、乙腈、四氢呋喃等试剂为色谱纯；乙醇分析纯。

2 方法与结果

2.1银杏叶粗提物的制备

称取1000g银杏叶，加入8倍量的70%乙醇，温浸提取4h，过滤，药渣再次提取2次，每次4h，合并过滤液。浓缩至1000mL后，加入4倍量的水冷藏过滤，得到银杏叶提取液，减压浓缩至干，得到银杏叶粗提物。

2.2银杏叶有效成分总黄酮醇苷和银杏内酯的含量测定

参照《中华人民共和国药典》2010年版一部银杏叶提取物项下总黄酮醇苷与萜类内酯含量测定方法[2]测定。

2.3大孔吸附树脂的优选

2.3.1大孔树脂的吸附率测定 将银杏叶提取物粗品溶于30倍的水中，分别量取50mL，加入经过前处理活化好的30g大孔吸附树脂LX-38、DM130、HPD-500、AB-8和D101，室温震荡24h后离心测定离心药液含量。平行进行3次试验并计算树脂的吸附率。测定结果见表1、图1。

2.3.2大孔树脂的解吸率测定 将离心完毕后的树脂加入75%的乙醇50mL，室温震荡24h，离心测定离心药液含量并计算树脂的解吸率。测定结果见表1、图1。

表1 树脂优选结果

注：表内数据为3次试验平均值。

图1 不同树脂对黄酮、内酯的吸附率和解吸率

从图1可以看到，不同树脂对银杏叶提取物中的黄酮和内酯的吸附不同。AB-8大孔吸附树脂的黄酮和内酯的吸附率较其他树脂高，而解吸率也较其他树脂高，说明树脂死吸附少，能将吸附的黄酮和内酯释放，利于精制纯化。AB-8型大孔吸附树脂是纯化银杏叶提取物的最佳树脂。

2.4银杏叶提取物柱层析精制方法

将银杏叶粗提物加30倍纯化水溶解，调节pH值，过滤，加入经过预处理(大孔树脂过筛，筛除小树脂和碎树脂，经10倍纯化水充分膨胀装柱，并经2%～3%盐酸浸泡4h后，用3倍体积2%～3%盐酸洗脱，然后使用纯化水洗脱至中性。再更换5%氢氧化钠溶液浸泡4h后，用3倍体积5%氢氧化钠溶液洗脱，再用纯化水洗脱至中性。再次更换95%乙醇浸泡4h后，用3倍体积95%乙醇洗脱，用纯化水洗至无醇，备用)的大孔树脂中，用2倍柱体积纯化水洗脱，然后更换低浓度醇洗脱1倍柱体积，然后更换高浓度醇洗脱3倍柱体积，并收集洗脱液，减压浓缩后干燥，即得银杏叶提取物精品。

2.5单因素考察结果及分析

在保持提取条件不变的情况下，依次考察上柱液体pH值(4.0、5.0、5.5、6.0、7.0)、低浓度醇浓度(5%、10%、15%、20%、25%)和高浓度醇浓度(60%、65%、70%、75%、80%)等3个因素，进行3次平行试验，排除误差，结果见图2。

图2 单因素试验结果

2.5.1上柱溶液pH值考察 将溶解后的银杏叶提取物pH值分别调节为4.0、5.0、5.5、6.0、7.0，然后上柱进行柱层析精制。用2倍柱体积纯化水洗脱，更换15%低浓度醇洗脱1倍柱体积，然后更换75%高浓度醇洗脱3倍柱体积并收集洗脱液，减压浓缩后干燥即得银杏叶提取物精品。结果显示，当液体pH在5.5左右时黄酮和内酯含量较高。分析原因为银杏黄酮类化合物多为具有一定的极性和酸性的多羟基酚类化合物，当pH为5.5时，呈酸性环境，银杏黄酮类化合物在酸性环境保持其分子状态，而大孔树脂也主要是吸附分子状态的化合物，从而容易被吸附并被有机溶剂洗脱而保留至产品中；内酯类化合物在弱酸性环境下也呈现分子状态而被保留至产品中[12]。

2.5.2低浓度醇浓度的考察 将溶解后的银杏叶提取物pH值调节为5.5，然后分别上柱进行柱层析精制，用2倍柱体积纯化水洗脱，更换5%、10%、15%、20%、25%低浓度醇洗脱1倍柱体积，然后更换75%高浓度醇洗脱3倍柱体积并收集洗脱液，减压浓缩后干燥即得银杏叶提取物精品。结果显示，15%的乙醇洗脱后终产品含量高。原因为低浓度醇洗脱(5%和10%)时，杂质未被洗脱除去，而较高浓度(20%和25%)洗脱时有效成分流失较多，从而影响终产品的含量。

2.5.3高浓度醇浓度的考察 将溶解后的银杏叶提取物pH值调节为5.5，然后分别上柱进行柱层析精制，用2倍柱体积纯化水洗脱，更换15%低浓度醇洗脱1倍柱体积，然后更换60%、65%、70%、75%、80%高浓度醇洗脱3倍柱体积并收集洗脱液，减压浓缩后干燥即得银杏叶提取物精品。结果显示，70%的乙醇洗脱3倍体积，总黄酮和内酯含量达到最高点，超过70%后，一些脂溶性杂质被洗脱带入终产品而降低了有效成分含量。

2.6响应曲面优化法试验设计及结果分析

依据Box-Behnken的中心组合设计原理，考虑单因素试验的结果设计自变量。以银杏叶提取物的总黄酮醇苷和萜类内酯含量为响应值，通过响应曲面分析进行银杏叶提取物柱层析精制工艺条件的优化。

2.6.1因素选择 单因素试验结果的基础上，选取对银杏叶提取物精制含量影响显著的3个因素(低浓度醇浓度X1、高浓度醇浓度X2和上柱溶液pH值X3)，采用3水平的响应曲面分析法进行试验设计。用Y1表示银杏叶提取物黄酮含量，Y2表示银杏叶提取物内酯含量。因素与水平选择见表2。

表2 中心组合试验因素和水平

2.6.2 响应曲面试验 利用Box-Behnken设计方法。按照下表进行试验，共含有15个试验点。Box-Behnken试验方案及结果见表3。

表3 响应曲面法试验方案及结果

2.6.3 模型的建立及其显著性检验 利用Design-Expert 8.0.6软件对表3试验数据进行回归拟合，分别得到Y1和Y2对X1、X2和X3二次多项回归模型：

Y1=28.65+1.79X1-1.40X2-0.044X3-0.08X1X2+0.58X1X3-0.72X2X3-1.47X12-1.64X22-1.86X32

Y2=10.53+0.58X1-0.053X2+0.26X3-0.46X1X2+0.08X1X3-0.39X2X3-0.92X12-0.29X22-

1.06X32

分别对该模型进行方差分析，结果见表4～5。

表4 Y1回归方程显著性检验

注：*为P<0.05；**为P<0.01。下同

表5 Y2回归方程显著性检验

由表4可知，回归模型差异有统计学意义，而失拟项P值均大于0.05，说明数据中没有异常点。该模型拟合程度良好，误差小，信噪比大于4，说明两个模型可以很好地分析和预测银杏叶提取物精制工艺的结果。

2.6.4 响应曲面分析 固定其中的一个因素，考察另外两个因素的响应面和等高线。从交互作用的模拟等高线和曲面图中发现AB、AC和BC等高线和曲面图相似。以AB为例，等高线为椭圆形，表示交互效应显著，方差分析表的P值为0.013 9<0.05，差异有统计学意义。从总黄酮含量方面考虑各个因素的影响程度，排序为A>B>C。见图3。

图3 Y1=f(A，B)的响应曲面和等高线

固定其中的一个因素，考察另外两个因素的响应面和等高线。我们也可以看到该模型中的AB和BC因素之间的交互效应显著。AC等高线为圆形，表示AC交互作用不明显。从内酯含量方面考虑各个因素的影响程度，排序为A>C>B。见图4。

图4 Y2=f(A，C)的响应曲面和等高线

2.6.5 响应曲面优化银杏叶提取物精制工艺条件 利用Design-Expert 8.0.6软件分析，银杏叶提取物最佳柱层析精制工艺：低浓度醇浓度为17.45%，高浓度醇浓度为66.70%，上柱溶液pH值为5.76。在最佳精制工艺条件下，银杏叶提取物理论的最高总黄酮含量为29.707 2%，最高内酯含量为10.718 4%。

2.7最优条件验证试验

在响应面软件分析所得的最佳条件下，进行3次验证试验，分别测定银杏叶提取物中的总黄酮醇苷和萜类内酯的含量，得到实际平均含量，并计算与模型给出的理论值的偏差。

全面验证该方法优化结果的可靠性，同时对优化数据进行简化。将精制工艺参数调整为低浓度醇浓度为18%，高浓度醇浓度为67%，上柱溶液pH值为5.8。并在此条件下连续进行了3次试验，银杏叶提取物的总黄酮含量分别为29.60%、29.51%和29.38%，平均值为29.50%，RSD=0.37%，其中槲皮素与山柰素的峰面积比平均为1.17，异鼠李素与槲皮素的峰面积比值平均为0.23；内酯含量分别为10.55%、10.61%和10.58%，平均值为10.58%，RSD=0.28%，其中内酯A含量为2.71%，内酯B含量为1.42%，内酯C含量为1.64%，白果内酯含量为4.81%，见图5。3批验证试验样品中未检出银杏酸，符合中华人民共和国药典规定。结果与理论值偏差总黄酮为0.7%，内酯为1.2%。结果表明，基于响应曲面法所得的优化提取条件准确可靠。3次验证试验(S1、S2、S3)的提取物总收率为2.2%，内酯A、B、C基本满足7∶3∶4的注射剂要求，可以满足舒血宁注射液的生产需求。

图5 验证试验HPLC图

3 讨论

通过响应曲面分析预测，并经过3次试验验证后得到了各因素的最佳值：低浓度醇浓度为18%，高浓度醇浓度为67%，上柱溶液pH值为5.8。3次验证试验结果表明重现性好，该方法所得银杏叶提取物含量满足中华人民共和国药典标准。

银杏叶提取物制备的难点在于黄酮和内酯的匹配，原料中黄酮和内酯不匹配会直接影响制剂产品最终的含量不匹配，导致某一含量过高而另一含量不合格。注射剂中要求内酯A∶B∶C=7∶3∶4，提取物中含量配备基本满足制剂的要求才能生产出合格的制剂产品。经过优化后的银杏叶提取物含量完全满足注射剂的生产要求。此外，银杏叶提取物精制过程中主要实现的是内酯和黄酮的富集，并去除过多的杂质类成分如多糖、蛋白及鞣质。经过多次试验发现，黄酮在经过柱层析后损失率约15%，而内酯损失较少，约3%～5%。而经过柱层析后的固体损失量约25%～30%，实现了减少杂质，提高有效成分的含量，达到精制的目的。

响应曲面优化法考虑了试验随机误差，并通过数据模拟出非线性的曲面模型，预测最优方案，方法简单。笔者利用响应曲面法进行多组试验的设计优化[13-14]，实现对多个因素多个水平的综合考察，加快了试验进度。

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StudyonOptimizationofRefiningProcessofColumnChromatographyofGinkgobilobaLeavesExtractsbyResponseSurfaceMethodology

FENGYukang1*，WANGWenpeng1，HAOPengbin1，CAIXiangjie1，ZHAOYuxin1，SUNShengbin2，JIANGGuozhi3

(1.ShinewayPharmaceuticalGroupCo.，Ltd.，Shijiazhuang051430，China；2.HebeiProvinceEngineeringResearchCenterforTCMInjection，Shijiazhuang051430，China；3.State-LocalJointEngineeringLaboratoryofNewDrugsDevelopmentTechnologyforTCMInjection，Shijiazhuang051430，China)

Objective：In order to get a higher content ofGinkgobilobaleaves extracts，Response Surface Methodology(RSM)are employed to optimize the refining process of column chromatography of Ginkgo biloba leaves extracts.Methods：Based on the single factor experiments，Box-Behnken design was applied to establish the mathematical model.The optimum refining process was investigated by response surface methodology with low ethanol concentration，high ethanol concentration and pH value of solution as influencing factors，and the content of total flavone and lactone were considered as index.Results：The results of RSM suggested that under the experimental conditions of low ethanol concentration 18%，high ethanol concentration 67%，pH value 5.8.The average product content of total flavone and lactone were 29.50% and 10.58% under above conditions.Conclusion：This optimized technology of column chromatography ofGinkgobilobaleaves extracts by response surface methodology is stable，and feasible，which could be extended to the applications of large-scale production

response surface methodology；Gingko leaves extract；column chromatography

中药大品种舒血宁注射液的技术改造及安全性评价(2014ZX09201022-004)

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冯玉康，工程师，研究方向：中药提取物工艺质量及产业化研究；E-mail：fykxy_206@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.12.023

2015-07-02)