桑叶中黄酮类和酚酸类成分的提取工艺优化△

李君，季涛，宿树兰，钱大玮

(南京中医药大学 江苏省中药资源产业化过程协同创新中心/中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心，江苏 南京 210023)

·中药工业·

桑叶中黄酮类和酚酸类成分的提取工艺优化△

李君，季涛，宿树兰*，钱大玮

(南京中医药大学 江苏省中药资源产业化过程协同创新中心/中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心，江苏 南京210023)

目的：对桑叶中黄酮类和酚酸类的提取工艺进行优化，以期为该类化学成分的资源化利用提供参考。方法：采用乙醇溶剂提取桑叶中黄酮类和酚酸类成分；采用正交试验对提取工艺参数进行优化；采用HPLC-DAD方法对其中3个黄酮类化学成分和3个酚酸类成分进行分析评价。结果：各因素对黄酮类成分提取率影响的程度排序为乙醇浓度>料液比>提取时间>提取次数；各因素对酚酸类成分提取率影响的程度排序为提取时间>提取次数>料液比>乙醇浓度。通过HPLC-DAD分析其中6个资源性化学成分的评价结果及方差，黄酮类、酚酸类成分的最佳提取工艺参数：乙醇浓度为85%，料液比为1∶40，提取时间为45min，提取次数为3次。结论：该提取工艺流程简单，提取率高，可为桑叶资源的开发利用提供参考。

桑叶；黄酮类；酚酸类；正交试验；提取工艺

桑叶为桑科植物桑MorusalbaL.的干燥叶，其性寒，味甘苦，具有疏散风热、清肺润燥、清肝明目的功能，临床上主要用于降血糖、降血脂等。现代研究表明，桑叶中主要含有黄酮类、生物碱类、多糖类成分，具有降血糖、降血压、降血脂、抗衰老、抗氧化等多种生理活性[1-2]。此外，桑叶中还含有植物甾醇类、微量元素类、维生素类、氨基酸类等成分[3-4]。大量研究表明，桑叶降血糖作用与黄酮类、多糖类、生物碱类化合物密切相关[5-8]，黄酮类是其降糖主要有效成分之一。桑叶中黄酮类化合物约占桑叶干重的1%～3%，其中包括以槲皮素为母核的黄酮类成分如槲皮素(quercetin)、桑苷(tutin)、芦丁(rutin)、异槲皮素(quercitrin)等；以山柰酚为母核的黄酮类成分如山柰酚(kaempferol)、紫云英苷(astragalin)等。桑叶中的有机酸类成分主要包括绿原酸(Chlorogenic acid)、新绿原酸(Neochlorogenic acid)、隐绿原酸(Cryptochlorogenic acid)等。Hunyadi A等[9]研究表明，桑叶中绿原酸成分具有降血糖作用。

笔者在相关文献报道的基础上[10-16]，对桑叶中黄酮类和酚酸类成分的提取工艺参数进行优化研究，通过正交试验、方法学考察，采用高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)同时分析评价桑叶中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、芦丁、异槲皮素和紫云英苷6种活性成分，明确了桑叶黄酮类和酚酸类成分的最佳提取工艺参数，以期为桑叶中该类资源性化学成分的开发利用提供参考。

1 仪器与试药

Waters 2695 Alliance高效液相色谱系统(四元泵溶剂系统、在线脱气机和自动进样器)；Sartorius BT125D型电子分析天平(德国赛多利斯公司)；KH-500DV超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；Anke LXJ-IIB型离心机(上海安亭科学仪器厂)；EPED超纯水系统(南京易普易科技发展有限公司)；PMB 53型快速水分测定仪(上海珂淮仪器有限公司)。

干燥桑叶购自安徽药材市场，经鉴定为桑科植物桑MorusalbaL.的干燥叶片。芦丁、异槲皮素、紫云英苷、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸(中国食品药品检定研究院，批号分别为LGNR-5N9L，Y-076-120325，Z-020-120312，110753-201314，MUST-14043010，MUST-14041410)；乙腈(色谱纯)；乙醇(南京化学试剂有限公司)；超纯水为实验室自制。

2 方法

2.1正交试验设计

考察了乙醇溶剂浓度(A)、料液比(B)、提取时间(C)和提取次数(D)4项因素，每项因素选用3个水平，以黄酮类和酚酸类成分含量为考察指标，采用L9(34)正交表安排试验，并对结果进行方差分析。

2.2提取方法

桑叶粉碎至粉末，精密称重3.0g，按表1所设计的试验条件，采用乙醇溶剂回流提取，过滤，离心浓缩，过滤膜，进行高效液相分析。

表1 桑叶黄酮和酚酸类正交试验因素水平表

2.3色谱条件

色谱柱：ACQUITYUPLCBEH(100mm×2.1mm，1.7μm)；流动相：0.1%甲酸水(A)，乙腈(B)，梯度洗脱(0～10min13%A；10～15min13%A；15～18min13%～20%A；18～43min20%A；43～45min20%～10%A)；流速：0.8mL·min-1；柱温：30℃；进样体积：10μL。

注：A.混合对照品；B.样品；1.新绿原酸；2.绿原酸；3.隐绿原酸；4.芦丁；5.异槲皮素；6.紫云英苷。图1 桑叶中黄酮类和酚酸类成分(6种)的HPLC图

2.4方法学考察

2.4.1标准曲线 按2.3项下色谱条件测定，以对照品的质量浓度(X)为横坐标，峰面积积分值(Y)为纵坐标，进行回归处理，得线性回归方程，芦丁：Y=2×109X-310 474(r=0.999 9)，线性范围为11.9～238 μg·mL-1；异槲皮素：Y=3×109X-424 299(r=1)，线性范围为14.3～286 μg·mL-1；紫云英苷：Y=4×109X-84 185(r=0.999 7)，线性范围为22.2～444 μg·mL-1；新绿原酸：Y=2×109X+4×106(r=0.999 6)，线性范围为19.3～334 μg·mL-1；绿原酸：Y=2×109X+4×106(r=0.999 0)，线性范围为19.3～540 μg·mL-1；隐绿原酸：Y=2×109X+8×106(r=0.999 1)，线性范围为32～438 μg·mL-1。

2.4.2 精密度试验 移取芦丁、异槲皮素、紫云英苷、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸对照品溶液，依照2.3项下色谱条件连续进样6次，以峰面积进行精密度考察，RSD分别为1.2%、0.9%、1.0%、1.1%、0.7%、0.9%(n=6)，表明精密度良好。

2.4.3 重复性试验 称取桑叶样品6份，每份约1 g，精密称定，分别制备供试品溶液，依照2.3项下条件进样分析，芦丁、异槲皮素、紫云英苷所对应的色谱峰面积的RSD分别为2.06%、0.47%和0.86%，说明所建立的液相分析方法重复性好。

2.4.4 稳定性试验 取同一供试品溶液，以芦丁、异槲皮素、紫云英苷、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸对照品分别在0、2、4、6、8、10、12 h进样，进行稳定性考察。结果表明，RSD分别为0.1%、0.4%、0.2%、0.6%、0.2%、0.4%(n=7)，说明提取的各组分在12 h内稳定性较好。

2.4.5 加样回收率试验 称取已知含量的桑叶样品6份，各约1.0 g，精密称定，分别按已知浓度的80%、100%、120%加入芦丁、异槲皮素、紫云英苷、绿原酸、隐绿原酸以及新绿原酸对照品，制备相应的供试品溶液，并依照2.3项下色谱条件进样分析，并按标准曲线法计算含量、加样回收率及RSD值。芦丁、异槲皮素、紫云英苷、绿原酸、隐绿原酸以及新绿原酸的加样回收率分别为95.2%、96.4%、93.6%、92.4%、95.1%、97.4%，RSD值分别为1.1%、1.6%、1.9%、2.1%、1.7%、1.9% 。

3 分析结果

试验结果见表2～6。由表2～6可看出，乙醇浓度、料液比、提取时间和提取次数对黄酮类和酚酸类成分提取影响程度不同。对黄酮类成分而言，各因素对提取率影响程度排序为乙醇浓度>料液比>提取时间>提取次数；各因素对酚酸类提取率影响程度排序为提取时间>提取次数>料液比>乙醇浓度。黄酮类成分的最佳提取工艺为A3B2C2D3；酚酸类成分的最佳提取工艺为A1B2C2D3。正交结果和方差分析结果表明，A3条件下黄酮类成分提取率明显优于其他参数，D3条件下酚酸类成分提取率明显优于其他参数，且差异均具有统计学意义。综合分析，确定桑叶黄酮类和酚酸类成分的最佳提取工艺参数为A3B2C2D3组合，即料液比为1∶40，85%乙醇回流提取45 min，提取3次。不同因素水平条件下，桑叶中黄酮类和酚酸类成分的含量见表4。

表2 L9(34)正交试验黄酮类成分分析结果

表3 方差分析

4 最佳提取工艺的验证试验结果

称取3份桑叶，各3 g，按正交试验设计优化得到的工艺条件进行提取试验，测定桑叶黄酮类和酚酸类成分含量。结果桑叶黄酮类成分质量分数分别为1.130、1.101、1.123 mg·g-1；酚酸类成分质量分数分别为3.821、3.798、3.810 mg·g-1，与正交试验最佳工艺组数据吻合，表明该最佳工艺提取桑叶黄酮类和酚酸类成分含量高，工艺稳定，结果可信。

表4 L9(34)正交试验酚酸类成分分析结果

表5 方差分析

表6 正交试验6种资源性化学成分的分析结果

5 结论与讨论

本文通过正交试验和验证试验，优化桑叶黄酮类和酚酸类成分的提取工艺参数。研究表明，桑叶黄酮类成分提取的影响因素排序为料液比>乙醇浓度>提取时间>提取次数；酚酸类成分提取的影响因素排序为提取次数>提取时间>料液比>乙醇浓度。但两类成分最佳工艺参数一致，均为料液比1∶40，85%乙醇回流提45 min，提取3次。

本试验采用HPLC-DAD分析方法同时测定桑叶中3种黄酮类和3种酚酸类成分，为建立桑叶多指标的质量评价模式提供参考。中药成分的复杂性决定了采用单一成分和指标来评价其质量具有较大的片面性，因此亟需建立多成分质量控制的评价模式。国内外对于桑叶活性成分的提取主要集中在总黄酮、生物碱和多糖成分的研究上[17-19]，而对于酚酸类成分的提取报道较少。本文建立的同时分析测定黄酮类与酚酸类资源性化学成分的HPLC-DAD分析方法，为桑叶及其制剂产品的质量控制，以及桑叶资源的开发利用提供了方法学参考和技术支撑。

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ExtractionOptimizationofFlavonoidsandPhenolicAcidsfromMulberryLeaves

LIJun，JITao，SUShulan*，QIANDawei

(JiangsuCollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization，NationalandLocalCollaborativeEngineeringCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrializationandFormulaeInnovativeMedicine，NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210023，China)

Objective：The study is aimed to optimize the extract parameters of flavonoids and phenolic acids from mulberry leaves in order to provide the basis for the resource utilization.Method：The ethanol solvent was selected to extract the flavonoids and phenolic acids from mulberry leaves.And the extraction parameters were optimized by orthogonal experiment and HPLC-DAD method was adopted to analyze the flavonoids and phenolic acids.Results：The results showed that the influence degree of various factors for flavonoids is：ethanol concentration>ratio of material to liquid>extraction time>extraction frequency.For phenolic constituents，the extraction frequency>extraction time>ratio of material to liquid>ethanol concentration.Based on the six bioactive compositions and variance analysis data，the optimal parameters of the extraction for flavonoids and phenolic acids were：ethanol concentration85%，ratio of material to liquid was1∶40，extraction time is45minutes，3times of extraction，respectively.Conclusion：The extraction process of flavonoids and phenolic acids from mulberry leaves has the advantages of simplicity，high extraction rate，and it provides the basis and reference for the development and utilization of mulberry resources.

Mulberry leaves；flavonoids；phenolic acids；orthogonal experiment；extraction optimization

国家自然科学基金项目(81373889，30973885)；教育部新世纪优秀人才支持计划项目(NCET-13-0873)

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宿树兰，副教授，研究方向：中药资源与利用；Tel：(025)85811916，E-mail：sushulan@njutcm.edu.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.12.020

2014-10-31)