基因芯片与传统罗氏培养检测结核分支杆菌药敏结果分析

张 伟

结核病是由结核杆菌感染引起的慢性传染病，结核病可蔓延至全身各个器官，但以肺脏为主，并通过呼吸道传播［1，2］。该病目前无彻底治愈的方法，临床主要以杀菌以及对症治疗为主，但部分患者停药后结核病又复发，病情甚至较之前加重。根据我院多年临床结核患者治疗资料显示，于结核发病早期对患者进行积极化疗，能有效提高临床疗效，将结核控制在较小范围。此外，对于部分耐药菌的诊断更是重中之重，因结核病治疗周期较长，早期发现耐药菌，可以提早使用针对性药物，为结核治疗争取更多时间，需要在临床加以重视［3－6］。结核杆菌耐药基因芯片诊断能有效增加结核杆菌耐药菌检出率，且该方法快速简便，可大规模开展［7，8］。为此，我院对116 株结核菌株进行检测，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 检测材料结核分支杆菌均由我院检验部提供，包括临床分离培养的结核杆菌菌株84 株(包括活检、肺泡或支气管灌洗以及胸腔积液中分离的菌株)以及痰标本结核杆菌菌株64 例。分离培养的结核杆菌以及痰标本均搜集自本院2013 年5 月至2015 年5 月于我院收治的结核病患者。以上菌株均于我院按照结核病细菌学检验标准化规程进行分离培养以及鉴定。菌株培养采用改良罗氏法，细菌的药敏试验采用绝对浓度法。

1.2 方法用取菌环刮取培养基上的菌落，将菌落溶于10 mL 双蒸水，用玻璃棒搅拌后放入离心机。以12 000 r/min 离心10 min，去除过滤出沉淀物，倒去上清液，用双蒸水继续溶解混匀，加入700 μmol/L 氢氧化钠溶液静置2 h，继续以12 000 r/min 离心10 min，滤出沉淀，用双蒸水洗净后，依次加入适量裂解液，吸附剂，煮沸，震荡后离心10 min，取上清液，用UNIQ-10柱对上清进行纯化并浓缩至150 μL 以待PCR 反应。随后分别经过rpoB 基因扩增、阳性扩增产物的回收、浓缩、测序以及测序产物的纯化。最后将产物用310型全自动DNA 测序仪(南京金斯瑞生物科技有限公司)进行测序，观察并记录下测序结果。

1.3 评价标准结果判定采用WHO 公布的标准，细菌在40 ～50 μg/mL 的异烟肼(isoniazid，INH)和利福平(rifampicin，RFP)的培养基上可以生长即判定为耐药。1.4 统计学方法 采用SPSS 21.0 进行统计分析，计数资料以例或百分比表示，统计分析采用χ2检验，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种检测方法结果比较我院按照全国结核病细菌学检验标准化规程进行分支杆菌分类以及鉴定，选取临床分离的结核杆菌84 株，其中耐INH 和耐RFP 菌株67 株，INH 或RFP 敏感菌株17 株。基因检测中耐药菌株69 株，65 株结果正确，敏感株检出15 株，13 株符合真实结果。耐药基因检测法灵敏度为97.01%，特异度为76.52%。阳性预测值为94.24%，阴性预测值为86.73%，两种检测方法的灵敏度和特异度差异无统计学意义(χ2=0.19，P ＞0.05)。见表1。

2.2 两种检测方法痰标本检测结果比较我院选取痰标本中结核杆菌64 株，其中耐INH 和RFP 菌株32株，INH 或RFP 敏感菌株32 株。基因检测结果中耐药菌株36 株，28 株结果与罗氏培养结果一致，敏感株检出28 株，24 株符合真实结果。耐药基因检测法灵敏度为87.56%，特异度为75.00%。阳性预测值为77.81%，阴性预测值为85.73%，与罗氏培养检验的敏感度和特异度差异无统计学意义(χ2=0.17，P ＞0.05)。见表2。

表1 两种检测方法分离菌株检测结果比较(例)

表2 两种检测方法痰标本检测结果比较(例)

2.3 耐药结核杆菌基因检测结果耐药结核杆菌检测结果如下:基因突变片段为516Mat 12 株，基因突变片段为526Mcg8 株，基因突变片段为526Mct 5 株，基因突变片段为526Mag 5 株，基因突变片段为531Mct 40 株，基因突变片段为516Mgt 5 株，其它基因突变片段14 株，可见耐药基因突变片段以531Mct 为主，其次为516Mat、526Mcg 以及526Mct、526Mag、516Mgt 等。

3 讨论

结核病是由结核分支杆菌感染引起的慢性传染病，结核病可侵犯人体多个系统，如呼吸、循环、免疫系统，对人体造成极大的损害［9，10］。虽然我国加大了结核病的防治力度，总的发病增长率有所下降，但我国结核病患者基数仍然比较庞大，需引起重视。结核的治疗是一个长期过程，目前各种关于结核杆菌药物的研究正在开展，但与此同时，随着抗结核药的广泛使用，以及部分患者药物滥用，各地不断报道有多耐药结核杆菌(multi drug resistant mycobacterium tuberculosis，MDR-TB)的出现。2002 ～2006 年，WHO 在进行了大规模的结核调查，调查结果显示多耐药结核菌正在全球迅速蔓延;在WHO 对全球184 个国家结核病患者的研究中发现，新近结核杆菌感染患者中出现242 794例MDR-TB 感染者，约占2.7%。而既往已接受治疗的患者中MDR-TB 感染率甚至达到了18.5%［11，12］。此外，同时感染HIV 和结核杆菌的患者中56%感染了MDR-TB。更加令人担忧的是部分地区对于多耐药结核杆菌的诊断受到多种因素的制约，无法第一时间对多耐药结核杆菌做出诊断，导致患者在长期使用各种常规化疗药物治疗后病情仍无缓解，甚至加重。临床常用的结核杆菌耐药性检查就是药敏试验，但该方法对于设备以及操作的要求较高，部分地区医院无法开展［13］。此外，操作中失误很容易造成最后结果出现假阳性或者假阴性，因此在临床难以普及。近年来，也有学者提出多种检测耐药菌株的方法，如:噬菌体荧光素酶法、氧化还原酶活性检测、BACTEC、微孔法［14，15］等，但要满足临床检测，尚需深入研究，以缩短检查所需时间。本研究主要针对结核病患者的耐药基因芯片检测技术，通过对116 株结核杆菌菌株进行研究，取得了一定的成果。

我院按照全国结核病细菌学检验标准化规程进行分支杆菌分类以及鉴定，选取临床分离的结核杆菌84株，其中耐INH 和耐RFP 菌株67 株，INH 或RFP 敏感菌株17 株。基因检测中耐药菌株69 株，65 株结果正确，敏感株检出15 株，13 株符合真实结果。耐药基因检测法灵敏度为97.01%，特异度为76.52%。阳性预测值为94.24%，阴性预测值为86.73%，两种检测方法无明显差异。基因检测技术对于分离培养的耐药结核菌株的检出，与药敏法无明显差异，效果可靠。我院选取痰标本中结核杆菌64 株，其中耐INH 和耐RFP菌株32 株，INH 或RFP 敏感菌株32 株。基因检测中耐药菌株36 株，28 株结果与罗氏培养结果一致，敏感株检出28 株，24 株符合真实结果。耐药基因检测法灵敏度为87.56%，特异度75.00%。阳性预测值为77.81%，阴性预测值为85.73%，两种检测方法检验效果无明显差异。基因检测技术对于痰标本中的耐药结核菌株的检出，与药敏法无明显差异，效果可靠。基因突变片段分别为516Mat 12 株、526Mcg 8 株、526Mct 5株、526Mag 5 株、531Mct 40 株、516Mgt 5 株、其它基因突变片段14 株，可见耐药基因突变片段以531Mct 为主，其次为516Mat、526Mcg 以及526Mct、526Mag、516Mgt等，临床对于结核杆菌基因型诊断需引起重视。

综上所述，结核杆菌耐药基因芯片检测技术，检测结果与罗氏培养药敏试验结果无明显差异，且用时较培养短，可大规模操作，值得在临床广泛推广。

［1］ 丁淑琴，徐文锦，杨园园，等.结核分支杆菌phoS2 重组质粒的构建、表达、纯化及生物信息学预测［J］.西安交通大学学报(医学版)，2014，25(3):306－310.

［2］ 陈根铭，赵双全，朱少乾，等.HRCT 在非结核分支杆菌肺病诊断及随访中的价值［J］.放射学实践，2013，28(3):315－318.

［3］ 梁雪妮，盛翔宇，孙炳奇，等.PCR-荧光探针法检测分枝杆菌的临床应用价值［J］.中国实验诊断学，2014，18(1):99－101.

［4］ 王谦信，陈兆俊，陆英，等.两种培养技术在结核分枝杆菌培养中的比较［J］.现代预防医学，2014，41(14):2617－2618.

［5］ 杨倩，王全凯，宋战昀，等.结核分支杆菌核酸适配体研究进展［J］.动物医学进展，2014，25(12):122－126.

［6］ 江莉莎，邬亭亭，刘平，等.分支杆菌噬菌体Leo 生物学特性及抗结核作用［J］.中国人兽共患病学报，2015，12(3):193－198.

［7］ 何玉龙，张文清，吴月红，等.一氧化氮在结核分支杆菌感染巨噬细胞中的作用研究进展［J］.动物医学进展，2014，35(7):90－93.

［8］ 齐花蕊，邱佳熠，王春芳，等.调节性T 细胞及在结核分支杆菌感染中的作用研究进展［J］.动物医学进展，2014，24(12):119－121.

［9］ 代旭磊，柳爱华，宝福凯，等.结核分支杆菌的分子检测技术研究进展［J］.现代预防医学，2012，39(8):2032－2034.

［10］陈菲菲，王春芳，钱爱东，等.非典型分支杆菌的分类鉴定方法研究进展［J］.湖北农业科学，2013，52(13):2977－2979.

［11］Si J，Wang Z，Wang Z，et al.Sequencing-based detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis in patients with spinal tuberculosis［J］.Arch Orthop Trauma Surg，2012，132(7):941－945.

［12］Abdul-Aziz AA，Elhassan MM，Abdulsalam SA，et al.Multidrug resistance tuberculosis(MDR-TB)in kassala state，eastern sudan［J］.Trop Doct，2013，43(2):66－70.

［13］Sagar T，Singh NP，Kashyap B，et al.Current status of multidrug resistant tuberculosis in a tertiary care hospital of East Delhi［J］.J Postgrad Med，2013，59(3):173－176.

［14］Cuevas-Cordoba B，Xochihua-Gonzalez SO，Cuellar A，et al.Characterization of pncA gene mutations in pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from Mexico［J］.Infect Genet Evol，2013，19(12):330－334.