连翘配方颗粒高效液相色谱指纹图谱

2015-09-15梁俊黄良永杨光义

医药导报 2015年7期

梁俊，黄良永，杨光义

(湖北医药学院附属太和医院药学部，十堰 442000)

连翘为木犀科植物连翘[Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl]的干燥果实，具有清热解毒、消肿散结、疏散风热的功效。用于痈疽，瘰疬，乳痈，丹毒，风热感冒，温病初起，温热入营，高热烦渴，神昏发斑，热淋涩痛[1]。主要含有挥发性成分、苯乙醇苷类、木脂素类和三萜类物质[2]，以连翘酯苷A和连翘苷的含量较高。现代研究表明，连翘酯苷A 对认知障碍及短暂性脑缺血的神经具有保护作用，故具有改善学习记忆障碍、舒张血管、抗氧化、抗菌、抗感染、解热、抗DNA损伤、防护耳毒性等药理作用[3]。连翘配方颗粒是以连翘为原料，经水提取、浓缩、喷雾干燥而制成的颗粒，有文献报道采用高效液相色谱(HPLC)法测定连翘配方颗粒中连翘苷含量[4-5]，但还没有统一的质量标准。笔者应用HPLC-梯度洗脱法，建立了连翘配方颗粒的HPLC指纹图谱，以便为建立质量标准提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 DGLC双三元高效液相色谱仪(美国Thermo公司，双三元梯度泵、WPS3000自动进样器、AccelaPDA二极管阵列检测器、TCC柱温箱);Chromeleon色谱工作站;Waters SunFire C18色谱柱(美国 WATERS 公司，4.6 mm ×150 mm，5 μm);520H 超声清洗机(南京熊猫电子集团，250 W，40 kHz);AUW120D电子分析天平(日本岛津公司，感量:十万分之一)。

1.2 试药甲醇为色谱纯(美国赛默飞公司)，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。连翘酯苷A对照品(批号:111810-201304，含量:94.3%)、连翘苷对照品(批号:110821-200711，含量:98.9%)均由中国食品药品检定研究院提供。连翘配方颗粒(广东深圳某医药股份公司生产，每袋1 g，相当于连翘药材10 g，批号:10041002S-S1、1011001S-S2、1103001S-S3、1105002SS4、 1107003S-S5、 1110001S-S6、 1203001S-S7、1302002S-S8、1307003S-S9、1311001S-S10)。

2 方法与结果

2.1 测定方法

2.1.1 色谱条件 Waters SunFire C18色谱柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流动相 A 为乙腈，流动相B为0.4%醋酸溶液，按表1程序进行线性梯度洗脱;流速:1.0 mL·min－1。柱温:30 ℃;检测波长:277 nm;进样 10 μL[1]。

表1 流动相线性梯度表Tab.1 Linear gradient table of mobile phase %

2.1.2 样品溶液的制备混合对照品溶液的制备:精密称取连翘酯苷A对照品21.70 mg，置25 mL棕色量瓶，加甲醇溶液超声溶解并稀释至刻度，摇匀，得储备液(每毫升含连翘酯苷A 868.0 μg);另精密称取连翘苷对照品20.60 mg置50 mL棕色量瓶，加甲醇溶液超声溶解并稀释至刻度，摇匀;即贮备液(含连翘苷412.0 μg)。再分别精密量取连翘酯苷A和连翘苷贮备液2.5 mL和0.5 mL置同一10 mL量瓶中，用甲醇溶液稀释至刻度，即得混合对照品溶液(每毫升含连翘酯苷 A217.0 μg，连翘苷 20.60 μg)。

供试品溶液的制备:取连翘配方颗粒研碎，过五号筛，精密称取0.5 g，置具塞锥形瓶，精密加入70%甲醇溶液15 mL，密塞，称定质量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇溶液补足减失的质量，摇匀，滤过。取续滤液，即得。

2.1.3 系统适用性实验精密取混合对照品溶液、供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，在“2.1.1”项色谱条件下，连翘配方颗粒的供试品溶液在对照品色谱相同的位置有连翘酯苷A和连翘苷的峰，二成分峰与其相邻峰完全分离，理论板数以连翘酯苷A峰计均＞18 000。二成分峰纯度经PDA检测器扫描对比符合度99.7%，说明和对照品的峰完全一致。结果见色谱图1。

2.2 指纹图谱方法学考察

2.2.1 精密度实验取同一供试品溶液(批号:1311001S-S10)，按“2.1.1”项色谱条件连续进样 5 次，每次10 μL，记录色谱图，测定主要共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果主要共有峰13个，1～13号峰相对保留时间的RSD均＜0.10%，相对峰面积的RSD均＜0.44%，符合指纹图谱要求，表明仪器精密度好。

2.2.2 重复性实验取同一样品(批号:1311001SS10)6份，按“2.1.2”项方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项方法进样测定并分别测定其色谱图，结果其相对保留时间稳定，主要共有峰1～13号峰相对保留时间RSD＜0.15%，相对峰面积RSD均＜0.90%，说明本方法重复性较好。

2.2.3 稳定性实验取同一样品(批号:1311001SS10)溶液在0，4，12，24 h 分别按“2.1.1”项方法进样测定并分别记录其色谱图，测定主要共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果主要共有峰13个，1～13号峰相对保留时间RSD均＜0.10%，相对峰面积RSD均＜0.48%，结果表明供试品溶液室温下0～24 h内成分保持稳定，能满足指纹图谱要求。

2.3 已知成分的鉴别和参比峰的确认供试品溶液和对照品溶液在“2.1.1”项色谱条件下得到的色谱图，通过色谱峰的保留时间和二极管阵列检测器的符合度检查比对，对指纹图谱中相应色谱峰进行确认，结果显示6号峰为连翘酯苷A;10号峰为连翘苷。其中6号连翘酯苷A峰的保留时间居中，峰面积值较大且稳定，所以选择6号峰为参比峰(图2)。

2.4 指纹图谱的建立和相似度评价取10批连翘配方颗粒样品，分别按“2.1.2”项供试品的制备方法处理，在“2.1.1”项色谱条件下，测定其色谱图。

利用中药指纹图谱相似度评价系统(2004 A版)软件，采用自动匹配法生成共有模式对照图谱R并分析各样品之间共有峰和相似度，确定共有峰。结果发现10批供试品共有13个共有峰，见图2和图3。各特征图谱与共有模式对照图谱R相似度见表2。以选定的6号峰连翘酯苷A峰为参比峰，设定其相对保留时间和峰面积为1，计算各共有峰相对它的相对保留时间和相对峰面积，结果见表3和表4。

3 讨论

图3 10批样品的HPLC指纹图谱相似度比较Fig.3 Similarity comparison of HPLC fingerprints among ten batches of samples

在筛选色谱条件时，流动相采用《中华人民共和国药典》2010年版连翘项下的含量测定方法，需要使用两个色谱条件分别测定连翘酯苷A和连翘苷的含量，对于HPLC指纹图谱的测定不太适应;笔者在本实验中采用乙腈-0.4%醋酸溶液进行梯度洗脱，流动相极性由大到小，使连翘酯苷A和连翘苷与其相邻色谱峰完全分离，可准确测定二成分的含量，取得满意结果。

建立样品的制备方法时，用不同比例的甲醇溶液(20%，40%，50%，70%，100%)直接超声提取，经过比较，采用《中华人民共和国药典》2010年版的方法，用70%乙醇溶液超声提取，两成分的回收率和重复性最好。

实验中发现，10批样品的HPLC指纹图谱中，13个共有峰的相似度均＞0.999，说明连翘配方颗粒的HPLC指纹图谱稳定可靠;各批号样品间13个共有指纹峰的相对保留时间比较吻合(RSD＜0.31%);相对峰面积波动较小(RSD＜10%)，说明该公司生产的不同批次颗粒的成分含量差异较小，生产颗粒的原药材来源一致，质量稳定。实验结果表明，利用HPLC色谱指纹图谱来控制连翘配方颗粒的质量切实可行，该法为该产品的质量控制提供了可行方法。