白假丝酵母菌最优化 RNA提取策略的探索

李赛男，祁文瑾

白假丝酵母菌最优化RNA提取策略的探索

李赛男，祁文瑾

目的 探索白假丝酵母菌总RNA简单、快捷、高效的提取方法。方法 选取昆明医科大学第一附属医院妇产科门诊2011年7月—2013年3月有临床症状且阴道分泌物镜检阳性的外阴阴道假丝酵母菌病（VVC）患者的白假丝酵母菌40株，选用不同时间与温度组合下的4种溶壁酶（Lyticase）破壁方案（A方案：37℃、12 h，B方案：25℃、12 h，C方案：37℃、24 h，D方案：25℃、24 h）进行RNA提取，将所得RNA进行荧光定量PCR（qPCR）反应验证RNA的浓度及纯度，并进行管家基因18S rRNA的检测。结果 D方案提取获得的RNA浓度高于A、B、C方案（P＜0.05）；B方案提取获得的RNA浓度高于A、C方案（P＜0.05）；而A、C两方案提取获得的RNA浓度比较，差异无统计学意义 （P＞0.05）。B、D方案获得的RNA纯度高于A、C方案 （P＜0.05）；但A、C方案获得的RNA纯度比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；B方案提取获得的RNA纯度高于D方案（P＜0.05）。A、B、C、D方案提取的RNA扩增产物Ct转化值比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中B、D方案qPCR扩增产物Ct转化值高于A、C方案（P＜0.05）；但B、D方案及A、C方案之间的 qPCR扩增产物Ct转化值比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。管家基因18S rRNA的引物扩增出的产物片段大小为150 bp。结论 以Lyticase破壁提取白假丝酵母菌具有简单易行及RNA产量高、纯度好的优点，值得临床推广应用。

白假丝酵母菌；RNA；聚合酶链反应；溶壁酶

李赛男，祁文瑾.白假丝酵母菌最优化RNA提取策略的探索［J］.中国全科医学，2015，18（2）：176-179. ［www.chinagp.net］

Li SN，Qi WJ.Strategy of optimizing RNA extraction from candida albicans［J］.Chinese General Practice，2015，18 （2）：176-179.

外阴阴道假丝酵母菌病 （vulvovaginal candidisis，VVC）是常见的外阴阴道感染性疾病，是由假丝酵母菌感染引起的阴道黏膜和/或外阴真菌感染。对假丝酵母菌分子生物学水平的研究常需提取其总 RNA，由于假丝酵母菌细胞壁主要是由几丁质组成，壁厚且坚硬，破壁一直是假丝酵母菌总RNA提取的关键步骤。目前，常用的假丝酵母菌破壁方法有：-80℃研磨破壁法、液氮研磨破壁法、酸洗玻璃珠破壁法［1-2］、Trizol法、改进Trizol法、超声粉碎法［3］、热酚法及改良热酚法［4］等，大多数方法对实验室要求较高，费时费力，且可能对环境和实验者造成一定危害。本研究旨在通过改良假丝酵母菌的破壁方法来获得一种理想的白假丝酵母菌RNA提取方法。

1　材料与方法

1.1实验材料

1.1.1菌株 选取昆明医科大学第一附属医院妇产科门诊2011年7月—2013年3月有临床症状且阴道分泌物镜检阳性的VVC患者的白假丝酵母菌40株，以沙堡罗氯霉素培养基（生物梅里埃，法国）培养获得纯化菌株，经科玛嘉显色培养基、安图显色培养基和Vitek（生物梅里埃，法国）菌种鉴定法确定为白假丝酵母菌后传代培养。菌株涂布于沙堡罗氯霉素平皿培养基37℃恒温培养24 h后，挑取单菌落接种于沙堡罗氯霉素斜面培养基常温保存，每半年转种于新制成的沙堡罗氯霉素斜面培养基一次，以保证菌株活性。

1.1.2主要试剂 沙堡罗氯霉素培养基（生物梅里埃，法国）、溶壁酶（Sigma，美国）、1 M山梨醇、0.1 M EDTA（pH=7.4）、0.1%β-巯基乙醇、用焦碳酸二乙酯 （DEPC）处理水制备的70%乙醇、三氯甲烷、无水乙醇、Ultrapure RNA Kit（中国康为世纪公司）、反转录试剂盒 （中国TransGenic公司）、UltraSYBR Mixture（中国康为世纪公司）。

1.1.3实验仪器 数显恒温水浴锅（上海梅香仪器有限公司）、PCR仪（BIO-RAD，美国）、紫外可见分光光度计 （NanoDrop，美国）、POWER PAC3000（BIORAD，美国）、凝胶成像分析系统（中国香港基因有限公司）。

1.2试验方法

1.2.1菌株准备 以无菌接种环挑取保存的纯化菌株接种于沙堡罗氯霉素培养基上，37℃过夜培养备用。

1.2.2白假丝酵母菌破壁 将37℃过夜培养的相同量白假丝酵母菌菌落溶于1 M山梨醇、0.1 M EDTA的液体中，使溶液OD600值在0.6～1.0，后置于1.5 ml eppendorf管中，加入0.1%β-巯基乙醇和50个单位溶壁酶，按照不同破壁时间和温度处理至溶液清亮。所用破壁温度和时间组合方案 （分别以A、B、C、D表示）详见表1。破壁后将清亮溶液置于4℃，5 000 r/min离心5 min，离心半径为10 cm，弃上清液得到白色细胞团。

表1　白假丝酵母菌破壁的4种组合方案Table 1 Four methods for disrupting the cell wall of Candida albicans

1.2.3RNA提取 使用Ultrapure RNA Kit，按照说明书提取假丝酵母菌总RNA。

1.2.4RNA定量 将以上不同条件处理所提取的RNA溶于20 μl RNase-Free Water中，取1 μl用NanoDrop （ND-1000）测量浓度，并以 A260/A280判定其纯度（以RNase-Free Water调零）。其余RNA立即置于-70℃冰箱保存备用。

1.2.5RNA反转录 使用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒（北京Transgen公司）进行cDNA合成。反应体系为20 μl，包含7 μl RNA，1 μl Anchored Oligo（dT）18Primer（0.5 μg/μl），10 μl 2×TS Reaction Mix，1 μl TranScript RT/ RI Enzyme Mix，1 μl gDNA Remover。以42℃孵育30 min。得到的cDNA置于-20℃冰箱保存。

1.2.6检测管家基因 以荧光定量PCR检测白假丝酵母菌中管家基因18S rRNA的表达［5］。反应体系为15 μl，包括7.5 μl 2×UltraSYBR Mixture，4.3 μl RNase-Free Water，2.0 μl Template DNA，上下游引物各0.6 μl，引物序列为：正向引物5′-TCTTTCTTGATTTTGTGGGTGG-3′，反向引物5′-TCGATAGTCCCTCTAAGAAGTG-3′。反应条件为95℃预变性10 min，95℃40个循环15 s，60℃ 退火1 min。以每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数（Ct值）来定量计算基因表达的效果，比较时把 Ct值转化为2-ΔCt进行。对荧光定量 PCR（qPCR）的产物进行琼脂糖（西班牙琼脂糖）凝胶电泳跑胶（跑胶是为了验证目的片段能否有效扩增以及对比Marker排除引物二聚体），使用POWER PAC3000电泳仪，180 V 20 min，Marker为TAKARA的DL500 DNA Marker。

1.3统计学方法 使用SPSS 17.0软件对数据进行统计学处理，不同提取方案获得的RNA浓度与纯度的比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1不同方案提取的RNA浓度与纯度比较 D方案提取获得的RNA浓度高于A、B、C方案，差异有统计学意义 （P＜0.05）；B方案提取获得的RNA浓度高于A、C方案，差异有统计学意义 （P＜0.05）；而A、C两方案提取获得的RNA浓度比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。B、D方案获得的 RNA纯度高于A、C方案，差异有统计学意义 （P＜0.05）；但A、C方案获得的RNA纯度比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；B方案提取获得的RNA纯度高于D方案，差异有统计学意义 （P＜0.05，见表2）。

2.2管家基因18S rRNA的扩增结果 不同方法提取的RNA反转录为cDNA后用于qPCR反应。A、B、C、D方案提取的RNA扩增产物Ct转化值比较，差异有统计学意义 （P＜0.05）；其中B、D方案qPCR扩增产物Ct转化值高于A、C方案，差异有统计学意义（P＜0.05）；但B、D方案比较及 A、C方案比较 qPCR扩增产物Ct转化值间差异无统计学意义（P＞0.05，见表2）。为了验证Ct值的可靠性，对qPCR的产物进行琼脂糖凝胶电泳跑胶，结果证明管家基因18S rRNA的引物扩增出的产物片段大小为150 bp，相对应的qPCR产物与其Ct值是可信的，且与Marker对比，确定所扩增的产物是目的基因（见图1、2）。

表2　不同方案提取RNA的浓度、纯度及扩增结果比较　（±s）Table 2 Comparison of the purity and quality of extracted RNA of Candidaalbicans in different scenarios

表2　不同方案提取RNA的浓度、纯度及扩增结果比较　（±s）Table 2 Comparison of the purity and quality of extracted RNA of Candidaalbicans in different scenarios

注：与A方案比较，*P＜0.05；与B方案比较，△P＜0.05；与C方案比较，▲P＜0.05

方案　株数　浓度（mg/L）　纯度（A260/A280）　18S rRNA（2-ΔCt）A　40　44.7±11.7　1.81±0.14　0.02±0.63 B　40　127.8±41.2*　2.08±0.14*　0.22±0.17*C　40　52.8±16.8△　1.78±0.17△　0.01±0.01△D　40　217.6±67.5*△▲　2.07±0.07*△▲　0.20±0.17*▲F值＜0.001　＜0.001　＜0.001 255.004　213.310　32.625 P值

图1　qPCR产物琼脂糖凝胶电泳结果Figure 1 The result of the product after qPCR

图2　不同方案下qPCR扩增18S rRNA的曲线图Figure 2 Amplification curves of 18S rRNA under different scenarios of qPCR

3　讨论

VVC是常见的妇产科感染性疾病，占微生物所致阴道炎的25.0%～30.0%，强烈的局部症状及易于复发为其特点。在1年内VVC症状发作≥4次者定义为复发性外阴阴道假丝酵母菌病（RVVC）［6-7］。随着临床广谱抗生素的大量应用，假丝酵母菌引起的感染耐药现象日益突出，并受到广泛关注。有研究显示，MDR、CDR、PDR等基因表达的异常可能是白假丝酵母菌耐药的机制，对这一机制的深入研究需以提取高质量的RNA为前提。由于假丝酵母菌细胞壁结构特殊，要想获得理想浓度和纯度的RNA十分困难。

目前，国内外学者提取假丝酵母菌常用的方法有超声波法、玻璃珠漩涡振荡、热酸性酚法、液氮研磨法、反复冻融法等，也有少部分学者使用过蜗牛酶破壁法［2-3，8］。在这些方法中，超声波法和玻璃珠漩涡振荡会打断RNA链，形成小分子RNA，不适于后续的分子生物学试验要求［9］。热酸性酚法耗时长，所用试剂多且实验中加入的酚类物质不易除去，最终易与RNA形成褐色复合物而导致RNA完全丧失生物学活性［10-11］。而液氮研磨法、反复冻融法等常用破壁方法虽然效果较好，但操作步骤繁琐，不适于大样本RNA的提取。蜗牛酶在很多年前就被用于破壁提取真菌的 DNA，但蜗牛酶是从蜗牛的嗦囊和消化道中制备的混合酶，其含有20多种酶，主要是纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、α-淀粉酶、甘露糖酶、蔗糖酶、半乳聚糖酶、蛋白水解酶、氨基酸转移酶等，是一种含有多种生物活性的混合酶，目前很难确定其在假丝酵母菌 RNA提取时对 RNA浓度、纯度的影响。

溶壁酶来自藤黄节杆菌（Arthrobacter luteus），是一种可以裂解活酵母细胞的放线菌所产生的酶，其中β -1，3-葡聚糖酶在裂解过程中起着关键作用。其能溶解许多真菌（包括担子菌、子囊菌、藻状菌和半知菌）的细胞壁而获得有活性的原生质体。近年来，有学者利用溶壁酶对真菌细胞壁的溶壁作用对VVC进行治疗，并且取得较好的效果。本研究以此为基础，创造性地选用溶壁酶进行假丝酵母菌破壁，并选用不同破壁时间和温度的组合来确定最佳的RNA抽提方案。结果提示，不同温度处理后RNA提取的产物浓度差异较大，处理的时间也对RNA的浓度有一定影响。在25℃时处理24 h左右（D方案）破壁效果最佳，经过此条件处理后可以提取到较高浓度和纯度的RNA。此外，本研究还对提取获得的总RNA进行了qPCR扩增，均获得了理想的18S rRNA扩增结果，证实除此提取方法能够充分满足后续试验的要求外，还进一步证实了溶壁酶破壁提取RNA的可行性。此外，本研究应用的溶壁酶破壁RNA提取的方法避免了超声波法和玻璃珠漩涡振荡对RNA片段的影响、酚类物质对RNA活性的影响，还避免了液氮研磨法、反复冻融法等对实验室条件要求高等不足，具有简单易行，RNA提取质量高、纯度好的优点，值得推广运用。

［1］Su HC，Cheng B，Fu LX，et al.Comparison of three different methods to extract Candida RNA by breaking cell walls［J］.Chinese Journal of Mycology，2007，2（5）：286-288.（in Chinese）苏惠春，程波，傅冷西，等.3种破壁方法提取念珠菌总RNA效果的比较［J］.中国真菌学杂志，2007，2（5）：286-288.

［2］Pan C，Wei X，Liu WH.A preliminary study on total RNA isolation by modified Trizol method［J］.Journal of Clinical Stomatology，2007，23（9）：531-533.（in Chinese）潘琤，魏昕，刘卫红.改进Trizol法提取白色念珠菌总RNA初探［J］.临床口腔医学杂志，2007，23（9）：531-533.

［3］Zhang Y，Ma M，Yu LH，et al.A study on total RNA isolation from early Candida albicans biofilm by modified hot phenol method［J］. Oral Biomedicine，2010，1（2）：65-67.（in Chinese）张琰，马鸣，虞丽华，等.改良热酸酚法提取白色念珠菌早期生物膜总RNA的研究 ［J］.口腔生物医学，2010，1（2）：65 -67.

［4］Chen LM，Xu YH，Zhou CL，et al.Overexpression of CDR1 and CDR2 genes plays an important role in fluconazole resistance in Candida albicans with G487T and T916C mutations［J］.Journal of International Medical Research，2010，38（2）：536-545.

［5］Yang H，Ye Y，Wang YC，et al.Research on strain and drug tolerance of vulvovaginal candidiasis［J］.Journal of Practical Obstetrics and Gynecology，2010，26（10）：756-758.（in Chinese）阳华，叶元，王玉春，等.外阴阴道假丝酵母菌病的菌种与耐药性研究［J］.实用妇产科杂志，2010，26（10）：756-758.

［6］Taskova RM，Zorn H，Krings U，et al.A comparison of cell wall disruption techniques for the isolation of intracellular metabolites from Pleurotus and Lepista sp［J］.Z Naturforsch C，2006，61（5/6）：347-350.

［7］Yilmaz R，Akça O，Baloglu MC，et al.Optimization of yeast （Saccharomyces cerevisiae）RNA isolation method for real-time quantitative PCR and microarray analysis［J］.African Journal of Biotechnology，2014，11（5）：1046-1053.

［8］Yi Y，Rong YP，Cheng QW，et al.Comparison of different cell wall disruption methods for yeast total RNA extraction［J］.Food Science，2011，32（11）：161-164.（in Chinese）易弋，容元平，程谦伟，等.不同破壁方法提取酵母菌总 RNA的比较 ［J］.食品科学，2011，32（11）：161-164.

［9］Yu HS，Peng S，Xie YH，et al.Study on improvement of RNA isolating reagent Kit-TRIZOL［J］.Food Science，2005，26 （11）：39-42.（in Chinese）于寒松，彭帅，谢远红，等.一种RNA提取试剂盒——TRIZOL的使用方法初探［J］.食品科学，2005，26（11）：39-42.

［10］Morozov IA，Sachivkina NP，Kravtsov EG，et al.Damaging effects of lyticase on Candida albicans and changes in the response of rat alveolar macrophages to the contact with yeast-like fungi［J］. Bulletin of Experimental Biology and Medicine，2011，151（6）：705-708.

［11］Sachivkina NP，Kravtsov EG，Wasileva EA，et al.Efficiency of lyticase（bacterial enzyme）in experimental candidal vaginitis in mice ［J］.Bulletin of Experimental Biology and Medicine，2010，149 （6）：727-730.

（本文编辑：李婷婷）

Strategy of Optimizing RNA Extraction from Candida Albicans

LI Sai-nan，QI Wen-jin.Department of Obstetrics andGynecology，the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming 650032，China

Objective To explore a simple，rapid and effective solution of extracting RNA from Candida albicans （C.albicans）.Methods From July 2011 to March 2013，in the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University，40 isolates simulated from vaginal secretion were identified as C.albicans.This study chose 4 Lyticase disrupting-wall programs at different time and temperatures（program A：37℃，12 h；program B：25℃，12 h；program C：37℃，24 h；program D：25℃，24 h）to extract RNA.The concentrations and purity of the extracted RNA were verified by real-time fluorescent quantitative PCR（qPCR）reaction and housekeeping gene 18S rRNA detection performed.Results The RNA concentration of program D was higher than those of programs A，B，C，the difference was significant（P＜0.05），that of program B was higher than those of programs A，C（P＜0.05），but there was no difference between programs A，C（P＞0.05）.The RNA purity programs B，D was higher than those of programs A，C（P＜0.05），but there was no difference between programs A，C （P＞0.05）.RNA purity of program B was higher than that of program D（P＜0.05）.There was difference in RNA amplified product Ct conversion value in programs A，B，C，D（P＜0.05），there into the qPCR amplified product Ct conversion value of programs B，D was higher than that of programs A，C（P＜0.05），but there was no difference between programs B，D and A，C（P＞0.05）.The product fragment size amplified by housekeeping gene 18S rRNA primers was 150 bp.Conclusion

Lyticase wall-disruption extacting C.albicans is simple，easy to operate，with high RNA products and good purity，which is worthy of promotion.

Candida albicans；RNA；Polymerase chain reaction；Lyticase

R 379.4

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.02.013

国家自然科学基金资助项目（81160076）

650032云南省昆明市，昆明医科大学第一附属医院妇产科

祁文瑾，650032云南省昆明市，昆明医科大学第一附属医院妇产科；E-mail：wenjinq@sohu.com

2014-06-21；

2014-10-11）