TCF7L2基因多态性与新疆维吾尔族人群 2型糖尿病的相关性研究

王志强，王婷婷，马　琦，苏银霞，马　艳，肖　珊，朱　筠，王淑霞，姚华

TCF7L2基因多态性与新疆维吾尔族人群2型糖尿病的相关性研究

王志强，王婷婷，马琦，苏银霞，马艳，肖珊，朱筠，王淑霞，姚华

目的 研究新疆地区维吾尔族人群TCF7L2基因单核苷酸多态性与2型糖尿病的相关性。方法 2012 年3月—2013年3月，应用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析质谱技术（MALDI-TOF），对新疆医科大学第一附属医院就诊的维吾尔族 2型糖尿病患者969例（T2DM组）和 958例体检健康者（NC组）的rs12255372和rs7085532进行基因分型；同时进行人体测量学及代谢指标的检测。结果 两组rs12255372多态性位点3种基因型，T、G等位基因频率比较，差异均有统计学意义 （P＜0.05）。非条件Logistic回归分析显示，T等位基因携带者患2型糖尿病的风险为G等位基因携带者的1.238倍〔OR=1.238，95%CI（1.049，1.461），P＜0.05〕；校正年龄、性别后 GT基因型携带者患2型糖尿病的风险为GG基因型携带者的1.221倍〔OR=1.221，95%CI（1.001，1.490），P＜0.05〕；GT+TT基因型携带者患2型糖尿病的风险为GG基因型携带者的1.252倍 〔OR=1.252，95%CI（1.033，1.516），P ＜0.05〕。两组rs7085532多态性位点3种基因型，A、G等位基因频率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论 TCF7L2基因rs12255372多态性位点可能与新疆维吾尔族人群2型糖尿病相关，而rs7085532多态性位点可能与新疆维吾尔族人群2型糖尿病无相关性。

TCF7L2基因；糖尿病，2型；等位基因；多态性，单核苷酸；维吾尔族

王志强，王婷婷，马琦，等.TCF7L2基因多态性与新疆维吾尔族人群2型糖尿病的相关性研究［J］.中国全科医学，2015，18（2）：157-161，165.［www.chinagp.net］

Wang ZQ，Wang TT，Ma Q，et al.Association between polymorphisms of TCF7L2 and T2DM in uygur population in Xinjiang［J］.Chinese General Practice，2015，18（2）：157-161，165.

2型糖尿病是一种复杂的多基因遗传性疾病，其发生与遗传、环境等因素相互作用有关。Grant等［1］于2006年首次报道TCF7L2基因多态性与冰岛、丹麦及美国人群2型糖尿病的发生有较强的相关性。随后TCF7L2基因与2型糖尿病的相关性在不同国家、地区和种族人群得到了验证。TCF7L2基因是目前发现的与2型糖尿病相关性最强的基因［2］。由于不同种族和地区人群在2型糖尿病的遗传和表型上具有异质性，同时疾病相关基因多态性位点的频率分布情况间也存在差异，因此本研究对新疆地区维吾尔族人群的TCF7L2基因rs12255372和rs7085532多态性位点进行相关性分析，了解TCF7L2基因两个多态性位点频率分布情况，探讨TCF7L2基因rs12255372和rs7085532是否与新疆地区维吾尔族人群2型糖尿病相关。

1　资料与方法

1.1一般资料 选择2012年3月—2013年3月在新疆医科大学第一附属医院就诊的维吾尔族2型糖尿病患者作为2型糖尿病组（T2DM组），共969例，其中男606例、女363例，平均年龄 （51.2±9.7）岁。2型糖尿病根据2007年中国糖尿病防治指南标准进行诊断：有糖尿病症状并伴有随机血糖≥11.1 mmol/L或空腹血糖≥7.0 mmol/L或既往有明确糖尿病病史、正在使用降糖药物或胰岛素者。选择同期在该院体检中心体检健康者作为正常对照组（NC组），共958例，其中男609例、女349例，平均年龄（50.3±9.8）岁。经详细询问病史和相关检查排除高血压、内分泌疾病、恶性肿瘤、冠心病、慢性肝肾疾病及其他慢性疾病。受试者为无血缘关系并且在新疆地区居住时间≥20年以上的常住人口，三代直系亲属均为维吾尔族，最大限度地排除了由于环境和地域差异而引起的基因变异。本研究方案经该院医学伦理委员会批准，受试者均自愿签署书面知情同意书。

1.2方法

1.2.1临床资料收集 使用统一制定的调查表，由经过培训的人员测量身高、体质量、腰围、臀围、血压，同时详细询问既往史及生活习惯并填表。

1.2.2血生化指标检测 清晨空腹抽取静脉血，检测血尿酸 （UA）、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、空腹血糖 （FPG）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、糖化血红蛋白（HbA1c）等生化指标。均采用新疆医科大学第一附属医院检验科的日立7600全自动生化分析仪测定，质控合格。

1.2.3基因组DNA的提取 受试者空腹抽取静脉血5 ml，充分抗凝处理后置于-80℃冰箱保存备用，采用全血基因组DNA提取试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司），对外周静脉血白细胞DNA进行提取，用分光光度计定量，琼脂糖凝胶电泳质检，基因组DNA电泳条带通常不小于20 kb。

1.2.4TCF7L2基因SNP分型检测 SNP检测过程结合多重PCR技术、单碱基延伸技术和基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析质谱技术（MALDI-TOF）进行分型检测。（1）引物设计：使用 Sequenom公司Genotyping Tools及MassARRAY Assay Design软件设计待测SNP位点的PCR扩增引物及单碱基延伸引物，并交由生物公司合成（见表1）。（2）PCR扩增：PCR扩增采用多重PCR技术，每个反应体系总体积为5.0 μl，包括10×PCR缓冲液0.5 μl，MgCl2（25 mmol/L）0.4 μl，dNTP mix（25 mmol/L）0.1 μl，PCR引物 mix 1.0 μl，HotStar Taq（5 U/μl）0.1 μl，H2O 1.9 μl，模板DNA 1.0 μl。PCR反应条件为94℃4 min，94℃20 s，56℃30 s，72℃ 1 min，总共45个循环，最后72℃ 3 min。（3）PCR产物碱性磷酸酶处理：在PCR反应结束后，将PCR产物用虾碱性磷酸酶（shrimpalkaline phosphatase，SAP）处理，以去除体系中游离的dNTPs。反应体系总体积为7 μl，包括PCR产物5 μl，H2O 1.53 μl，SAP缓冲液（10×）0.17 μl，SAP（1.7 U/μl）0.3 μl（Sequenom）。反应条件为37℃40 min，85℃5min。（4）单碱基延伸：在碱性磷酸酶处理结束后，进行单碱基延伸反应。反应体系总体积9 μl，包括PCR产物7 μl，H2O 0.619 μl，单碱基延伸酶（iPLEX）缓冲液0.2 μl，iPLEX终 止 物0.2μl，iPLEX0.041μl （Sequenom），各延伸反应引物混合物0.94 μl；反应条件为94℃30 s，94℃5 s，52℃5 s，80℃5 s，总共40个循环，最后72℃3 min。（5）树脂纯化：将Clean resin树脂平铺到6 mg的树脂板中，加16 μl H2O到延伸产物中，将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转30 min，使树脂与反应产物充分接触。（6）芯片点样：启动MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP（Sequenom）芯片上。 （7）质谱检测：将点样后的SpectroCHIP芯片使用 MALDI-TOF分析，检测结果使用TYPER 4.0软件分型并输出结果。

1.3统计学方法 采用SPSS 16.0软件包对数据进行处理，计算TCF7L2基因型及等位基因频率，检验各群体是否符合Hardy-Weinberg遗传平衡原理，能否代表相应人群；计量资料以（±s）表示，两组间比较采用t检验及协方差分析；等位基因及基因型频率比较采用χ2检验；采用非条件Logistic回归分析等位基因及基因型与疾病的相关性。以P＜0.05为差异有统计学意义。

表1　rs12255372和rs7085532的PCR引物序列Table 1 Sequence of PCR primers for rs12255372 and rs7085532

2　结果

2.1一般资料和实验室检查指标比较 T2DM组年龄高于NC组，差异有统计学意义 （P＜0.05），两组性别构成、臀围、BMI、收缩压 （SBP）、Cr、TG比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；两组腰围、舒张压（DBP）、UA、FPG、BUN、HbA1c、TC、HDL-C、LDL -C水平比较，差异均有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

2.2Hardy-Weinberg平衡检验TCF7L2基因rs12255372和rs7085532多态性位点在T2DM组（χ2= 0.70、0.197）和NC组 （χ2=0.22、5.908）基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P＜0.05），所取样本具有群体代表性，能够反映新疆地区维吾尔族人群的总体情况。

2.3TCF7L2基因rs12255372及rs7085532多态性位点基因型和等位基因频率分布 两组rs12255372多态性位点3种基因型比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；两组T、G等位基因频率比较，差异有统计学意义（P ＜0.05，见表3）。非条件Logistic回归分析显示，T等位基因携带者患2型糖尿病的风险为G等位基因携带者的1.238倍〔OR=1.238，95%CI（1.049，1.461），P ＜0.05〕；校正年龄、性别后GT基因型携带者患2型糖尿病的风险为GG基因型携带者的1.221倍〔OR= 1.221，95%CI（1.001，1.490），P＜0.05〕；GT+TT基因型携带者患2型糖尿病的风险为GG基因型携带者的1.252倍〔OR=1.252，95%CI（1.033，1.516），P ＜0.05〕。

表2　两组一般资料和实验室检查指标比较Table 2 Comparison of general data and laborotory indexes between the two groups

两组rs7085532多态性位点3种基因型比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；两组A、G等位基因频率比较，差异无统计学意义 （P＞0.05，见表4）。

表3　两组　rs12255372多态性基因型及等位基因频率比较　〔n（%）〕Table 3 Comparison of genotype distribution and allele frequencies ofrs12255372 between the two groups

表4　两组　rs7085532多态性基因型及等位基因频率比较　〔n（%）〕Table 4 Comparison of genotype distribution and allele frequencies ofrs7085532 between the two groups

2.4TCF7L2基因rs12255372多态性位点不同基因型受试者一般临床资料和实验室检查指标比较

2.4.1T2DM组不同基因型一般临床资料和实验室检查指标比较 采用协方差分析校正年龄、性别后显示，GT+TT基因型组的BUN、LDL-C水平高于GG基因型组，差异有统计学意义 （P＜0.05）；两组腰围、臀围、BMI、SBP、DBP、UA、FPG、Cr、HbA1c、TG、TC、HDL-C比较，差异均无统计学意义（P＞0.05，见表5）。2.4.2 NC组不同基因型受试者间一般临床资料和实验室检查指标比较 采用协方差分析校正年龄、性别后显示，GT+TT基因型SBP、DBP水平高于GG基因型，差异有统计学意义（P＜0.05）；两组腰围、臀围、BMI、UA、FPG、BUN、Cr、HbA1c、TG、TC、HDL-C、LDL -C比较，差异均无统计学意义 （P＞0.05，见表6）。

3　讨论

TCF7L2又名淋巴细胞因子4（TCF4），位于人类染色体10q25.3，其表达的蛋白质为β连环素的核受体，是一种在Wnt信号途径中发挥重要作用的关键蛋白，具有促进细胞增殖和分化以及调控肠道L细胞合成胰升糖素样肽 （GLP-1）的作用。GLP-1和抑胃肽 （GIP）是两种重要的肠促胰岛素分泌因子，由于能够促进β细胞的增殖和存活，并且能够增强葡萄糖刺激引起的胰岛素分泌，因此成为糖尿病治疗的重要靶点［3］。Yi等［4］研究发现TCF7L2基因可以通过Wnt信号途径来调节具有内分泌功能的小肠L细胞分泌具有促进胰岛素分泌的GLP-1，因此 TCF7L2基因对血糖稳态的调节至关重要。TCF7L2基因的变异可能会使GLP-1分泌减少，从而引起胰岛素分泌的减少，最终导致糖尿病的发生。Shu等［5］发现TCF7L2基因与胰升糖样肽受体 （GLP-1R）/促胰岛素样多肽受体 （GIP-R）表达及信号传导之间的相互作用来调节β细胞的功能和存活。Lyssenko等［6］研究发现胰岛素分泌减少、肠促胰岛素分泌效果受损、肝糖生成率增强可能是由于携带TCF7L2风险基因造成。在2型糖尿病患者的胰岛组织中，TCF7L2基因表达增加了5倍，过度表达会减少葡萄糖刺激引起的胰岛素分泌。TCF7L2的基因变异可能会影响肠胰岛素调控轴，进一步增强了TCF7L2基因在胰岛组织中的表达，减少胰岛素的分泌，进而增加了2型糖尿病的风险。

表5　T2DM组　rs12255372不同基因型患者一般临床资料和实验室检查指标比较Table 5 Comparison of clinical characteristics and laborotory indexes between different rs12255372 genotypes in T2DM group

表6　NC组　rs12255372不同基因型间的一般临床资料和实验室检查指标比较Table 6 Comparison of clinical characteristics and laborotory indexes between different rs12255372 genotypes in NC group

由于不同种族的遗传背景及其环境暴露是有差异的，因此已报道的疾病相关基因或位点对人类复杂遗传性疾病的研究具有重要意义。Florez等［7］对美国人群研究发现rs12255372多态性位点与2型糖尿病显著相关，其中T等位基因在美国黑人的分布频率为31%，在西班牙裔美国人的分布频率为23%，在亚裔美国人的分布频率为14%，在美国印第安人的分布频率为5%。Cauchi等［8］对法国人群研究发现，rs12255372多态性位点与2型糖尿病显著相关，T等位基因携带者患2型糖尿病的风险为G等位基因型者的1.60倍（OR=1.60）。van Vliet-Ostaptchouk等［9］对荷兰人群研究发现，rs12255372多态性位点与2型糖尿病显著相关，T等位基因频率在T2DM组为34%，在NC组为29%。Kimber等［10］对英国受试者研究发现，rs12255372多态性位点与2型糖尿病显著相关。T等位基因在T2DM组和NC组分布频率分别为33.3%和27.2%。Hayashi等［11］对日本人群研究发现，rs1225372多态性位点与2型糖尿病显著相关，T等位基因在T2DM组和NC组分布频率分别为3.6%和2.2%。TCF7L2基因rs12255372多态性与2型糖尿病相关性的研究在欧美和日本的不同种族获得了重复性较好的阳性结果。

本研究结果显示，rs12255372 T等位基因在T2DM组和NC组分布频率分别为19.3%和16.2%；GT、TT基因型的分布频率在T2DM组和NC组之间有明显差异；T等位基因携带者患2型糖尿病的风险为G等位基因携带者的1.238倍（OR=1.238）。表明T等位基因可能是2型糖尿病的风险等位基因，非条件Logistic回归校正年龄、性别后显示GT基因型携带者患2型糖尿病的风险为GG基因型携带者的1.221倍（OR=1.221）；GT+TT基因型携带者患2型糖尿病的风险为GG基因型携带者的1.252倍（OR=1.252），提示TCF7L2基因rs12255372多态性位点可能与新疆维吾尔族2型糖尿病的发生相关。本研究结果还显示，T2DM组协方差分析校正年龄、性别后，GT+TT基因型患者BUN、LDL-C水平均显著高于GG基因型患者；NC组协方差分析校正年龄、性别后，GT+TT基因型患者SBP、DBP水平均显著高于GG基因型患者，提示T等位基因可能与血脂代谢紊乱和血压的升高有关。然而中国Ren等［12］研究发现TCF7L2基因编码区遗传变异与中国北京汉族人群2型糖尿病无相关性，rs12255372 T等位基因频率为0.9%。Ng等［13］对中国香港人群的研究发现TCF7L2基因的rs1196205和rs11196218与2型糖尿病显著相关，但对rs12255372未做检测。Chang等［14］对中国台湾人群研究发现 TCF7L2基因多态性与2型糖尿病相关，但rs12255372与中国人群2型糖尿病无相关性。娄青林等［15］对无血缘关系的江苏地区汉族人群研究发现rs12255372 T等位基因频率为0.55%，低于白种人和日本人。rs12255372基因多态性与2型糖尿病相关性的研究在中国汉族人群中有很大差异，T等位基因频率明显低于维吾尔族人群，可能是由于汉族人群与维吾尔族人群具有不同的遗传背景和环境暴露所致。

本研究还发现，rs7085532 G等位基因在T2DM组和NC组分布频率分别为38.3%和39.2%；AG、GG基因型频率的分布在 T2DM组和 NC组间无明显差异。提示TCF7L2基因rs7085532多态性位点可能与新疆维吾尔族2型糖尿病的发生无关。

综上所述，TCF7L2基因的rs12255372位点与新疆维吾尔族人群2型糖尿病可能具有相关性，其风险等位基因频率高于中国汉族人群；而rs7085532位点可能与新疆维吾尔族人群2型糖尿病无关。

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（本文编辑：赵跃翠）

Association between Polymorphisms of TCF7L2 and T2DM in Uygur Population in Xinjiang

WANG Zhi-qiang，WANGTing-ting，MA Qi，et al.College of Public Health，Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China

Objective To study the association between transcription factor 7-like 2（TCF7L2）polymorphisms and type 2 diabetes mellitus（T2DM）in Uygur nationality in Xinjiang.MethodsFrom March 2012 to March 2013，2 polymorphisms（rs12255372 and rs7085532）of TCF7L2 gene were genotyped in 969 T2DM patients from Xinjiang Medical University，the First Affiliated Hospital of Uygur（T2DM group）and 958 normal subjects（NC group）by matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight（MALDI-TOF）.At the same time，the anthropometry and metabolism indices were measured.Results T allele frequency and GT，TT，3 genotypes frequencies of rs12255372 were significantly different between T2DM group and NC group（P＜0.05）.The risk of T2DM was 1.238 times higher in patients with T allele than in those with G allele〔OR=1.238，95%CI（1.049，1.461），P＜0.05〕，1.221 times higher in patients with GT genotype than in those with GG genotype after adjusting age，gender〔OR=1.221，95%CI（1.001，1.490），P＜0.05〕，1.252 times higher in patients with GT+TT genotype than in those with GG genotype〔OR=1.252，95%CI（1.033，1.516），P＜0.05〕.There was no significant difference in 3 genotypes，A，G alleles of rs7085532 polymorphic sites between the 2 groups（P＞0.05）. Conclusion The rs12255372 polymorphisms in TCF7L2 gene may be associated with T2DM，while rs7085532 polymorphisms may not in Uygur population in Xinjiang region.

TCF7L2gene；Diabetesmellitus，type2；Alleles；Polymorphism，singlenucleotide；Uygur nationality

R 587.1

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.02.009

国家重点基础研究发展计划（973计划）（2012CB722403）；新疆重大疾病医学重点实验室开放课题（SKLIBXJMDR-2012-Y4）

830011新疆乌鲁木齐市，新疆医科大学公共卫生学院（王志强，王婷婷，苏银霞，马艳）；新疆医科大学第一附属医院代谢性疾病重点实验室（马琦，肖珊，朱筠，姚华），体检与健康管理中心（王淑霞）

姚华，830054新疆乌鲁木齐市，新疆医科大学第一附属医院代谢性疾病重点实验室；E-mail：yaohua01@sina.com

2014-07-10；

2014-11-15）