楚雄地区不同生境下何首乌中二苯乙烯苷HPLC测定*

鲁菊芬，华燕，郭乔仪，王洪丽，张金渝

(1.云南省楚雄农业学校，云南 楚雄 675000;2.西南林业大学，云南 昆明 650224;3.云南省农业科学院药用植物研究所，650231)

1.概述

何首乌 (Polygonum multiflorum Thunb)为蓼科 (Polygonaceae)多年生缠绕藤本植物。性味甘、涩、微温;根据炮制方法不同分为生首乌和制首乌。生首乌:具有润肠通便、解毒和截疟的功效，用以治疗肠燥便秘、疟疾和疮痈肿毒;制首乌:具有补益精血和固肾乌须的功效，用以治疗肝肾不足、精髓亏虚所导致的眩晕耳鸣、重听、失眠、健忘、惊悸怔忡及须发早白。

何首乌的化学成分主要为蒽醌类化合物、二苯乙烯甙类化合物、聚合原花青素以及卵磷脂和微量元素。经过药理和临床研究发现何首乌总结起来具有以下作用:抗衰老作用、对神经的保护作用、对免疫系统的影响、降血脂及抗动脉粥样硬化作用 (血液循环)、保肝作用、对心血管系统的作用、对内分泌的影响、对肠蠕动的影响等作用。

下面将采自云南楚雄市野生何首乌和来自楚雄农校人工栽培2年何首乌做二苯乙烯苷测定。

2.材料与方法

具体方法按照《中华人民共和国药典》(2005版)要求进行测定。

2.1 试验仪器及色谱条件

色谱条件:乙腈:水 (22:78);检测波长:320nm;进样量:5ul;色谱仪:安捷伦1200系列;色谱柱:Eclipse XDB－C18(4.6*150mm，5um);柱温:25℃。

2.2 试验材料

对照品:2，3，5，4，—四羟基二苯乙烯－－O－β－D－葡萄糖苷，购于中国药品及生物制品检定所，溶剂均为分析纯，流动相为色谱纯。

1号样品:野生何首乌，采自云南楚雄市，经西南林业大学杜凡教授鉴定为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum的块根。样品粉碎后过60目筛网，于60℃干燥4h后置干燥器中备用。

2号样品:2005年引自贵州凯里，生育期4个月零25天、高0.25～0.35m何首乌扦插苗在楚雄农业学校人工栽培2年，样品粉碎后过60目筛网，于60℃干燥4h后置干燥器中备用。

2.3 试验样品的制备

供试品溶液:精密称取何首乌超微粉0.1g，置于具塞锥形瓶中，加入20mL 70%乙醇，充分溶解，超声振荡30min，过滤，滤液置10mL容量瓶中，加70%乙醇，定容。作为供试品溶液，备用。

对照品溶液:精密称定二苯乙烯苷标准品50mg，置于25mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀。作为对照品溶液，备用。(每1mL中含二苯乙烯苷标准品2mg)。

阴性样品溶液:制备不含何首乌的阴性样品，按供试品溶液制备的方法制备阴性溶液。即得。

2.4 试验方法与结果

标准曲线的绘制:分别取对照样品、供试样品1和供试样品2溶液注入色谱仪，记录色谱图，考察线性关系，做出何首乌标准曲线图。

样品测定:按照上述方法制备各样品的何首乌供试样品溶液，分别测定2，3，5，4，—四羟基二苯乙烯－－O－β－D－葡萄糖苷。

3.结果与分析

3.1 标准曲线的绘制

(1)最大吸收波长的测定:精密称定对照品溶液0.0，2.0mL，分别置10mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀。用1cm比色皿在波长200－400nm区间以空白溶液为对照进行扫描。

根据扫描曲线可知，二苯乙烯苷标准品在波长200－400nm区间有强吸收，最大吸收波长为320 nm。故本试验选用320 nm为测定波长。

(2)色谱条件:乙腈:水 (22:78);检测波长:260nm;进样量:5ul;色谱仪:安捷伦1200系列;色谱柱:Eclipse XDB－C18(4.6*150mm，5um);柱温:25℃。对照品、样品色谱图见图1、图2、图3。

图1 二苯乙烯苷色谱图

图2 何首乌样品1色谱图

结果表明，在现行色谱条件下，二苯乙烯苷与其他组分得到很好分离，指标成分色谱峰理论塔板数均不小于2000，指标成分色谱峰与其他峰分离度均大于1.5。阴性样品色谱图在待测成分保留时间处无色谱峰，对样品测定无干扰。

(3)线性关系考察:精密称取二苯乙烯苷对照品 (每1mL中含二苯乙烯苷标准品2mg)溶液0.0、1.0、2.5、5、8、10 mL置6个10 mL容量瓶中，用甲醇溶解，定容。在上述色谱条件下，每份3次，每次进样10 uL，以峰面积及其对应的质量浓度进行回归。得回归方程y=3533.9x–14.462，r=0.9998，线性范围为0.2～2.0 mg/mL。

(4)精密度试验:取二苯乙烯苷对照品溶液进样5 uL，连续进样5次，测定峰面积，结果峰面积RSD%为1.07%。

(5)稳定性试验:取何首乌药材提取液，置室内自然光下方置，于0、4、6、8、12、24 h，测定峰面积，计算。结果药材提取液在24 h内稳定，二苯乙烯苷的RSD% 为2.14%。

图4 何首乌的标准曲线

(6)重现性试验:取同一批样品5份，制备供试品溶液，进样进行测定，结果二苯乙烯苷的RSD%为2.73。

3.2 样品含量测定

取2个不同产地的何首乌样品，按照前面的方法制备供试品溶液，每次进样5 uL，按标准曲线法，测定结果见表2。

表2 何首乌中二苯乙烯苷的测定结果 (n=2)

上述通过对不同生境何首乌中二苯乙烯苷的HPLC测定结果表明，楚雄市野生何首乌和人工栽培何首乌药材中2，3，5，4，—四羟基二苯乙烯－－O－β－D－葡萄糖苷的含量差别很大，野生的为1.42%，而人工种植的为11.93%。由于所有的研究样品均为何首乌的块根，因此认为其含量的差别和生境有关。

4.结论

本试验通过对不同生境下何首乌 (野生和家种)的有效成分含量测定，结果表明:产量、生长期上人工种植两年的相当于野生8—10年何首乌;药用价值上测定2，3，5，4—四羟基二苯乙烯－－O－β－D－葡萄糖苷含量，人工栽培2年的比野生8～10年的高近8倍。因此，栽培和野生的其产量、生长期及药用价值相差甚大，人工科学规范化栽培何首乌具有极大的意义。

本文研究样品产地来源明确，用药典规定方法测定，结果具有代表性。以前有一些文献研究报道了不同产地何首乌的块根中二苯乙烯苷的HPLC测定，但对不同生境 (栽培环境)下2，3，5，4，—四羟基二苯乙烯－－O－β－D－葡萄糖苷的含量不同，属于首次研究，它将为今后开展规范化、规模化种植和深入开发何首乌资源有指导意义。

［1］李建北，林茂.何首乌化学成分的研究 ［J］.中草药，1993，24(3):115—118.

［2］周立新，林茂.何首乌乙酸乙酯不溶部分化学成分的研究 ［J］.药学学报，1994，29(2):107—110.

［3］张丽艳，杨玉琴，高言明.贵州不同产地野生及栽培何首乌中二苯乙烯苷含量比较［J］.中国中药杂志，2003，28(08):786—687.

［4］王文静，张维明，董小玲，等.滇产何首乌药材的化学成分研究［J］.云南中医学院学报，2005，8(1):10—12.

［5］廖海民，胡正海.何首乌的生物学及化学成分研究进展 ［J］.中草药，2005，36(2):311—314.

［6］廖海民，王玲丽，唐玲玲，等.不同产地何首乌中而苯乙烯的测定 ［J］.中草药，2006，37(4):603—604.

［7］兰茂.滇南本草 ［M］.昆明:云南科技出版社，2004，9:59—60.

［8］周秀英.何首乌抗衰老研究概述 ［J］.实用中医药杂志，2007，23(6):399—400.

［9］邢淑慧，贾少谦.何首乌的现代药理研究及临床应用 ［J］.中国医药导报，2006，2(26):123—124.

［10］张印发.何首乌的药理作用研究 ［J］.中国现代医生，2007，45(15):149—151.

［11］高瑄，胡英杰，符林春.何首乌二苯乙烯苷的调节血脂作用 ［J］.中国中药杂志，2007，32(4):323—325.

［12］刘黎明，王艳颖.何首乌的药理作用和临床应用研究 ［J］.黑龙江医药，1999，12(2):91.