牛羊布鲁氏菌病四种血清学检测方法对比分析

齐景文，依颖新，周艳红，雷 蕾，杨蕴力，李 祺

（沈阳市动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳 110034）

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的一种广泛分布于世界各地的人畜共患的传染病，人类感染后，病程长，反复发作，长期不愈，家畜感染则出现流产和不育，严重危害畜牧业生产和人类健康。近年来，布病在许多国家和地区再度肆虐[1]，尽管这些国家和地区都采取各种防控措施，也取得了一定成效，但布病防控工作仍是一个长期而艰巨的任务。

目前，我国布病的血清学检测方法主要有虎红平板凝集试验（RBT）、试管凝集试验（SAT）、补体结合试验（CFT）等，RBT用于初筛，SAT和CFT用于诊断定性，就SAT而言，存在一定的假阳性和假阴性[2]，对诊断定性和阳性畜的扑杀有一定影响，而CFT操作复杂，对检测者要求高，特异性很好，但有一定假阴性，会出现漏检现象，对布病的净化不利，我们希望通过对国际贸易指定的ELISA检测方法与国家标准的方法进行比对分析，能为国家标准修订提供参考。

1 材料与方法

1.1 被检血清

血清样本为2009-2014年沈阳8涉农区县（市）送检复核样本669份，其中奶牛样本383份，羊样本286份。

1.2 试剂

布鲁菌病虎红平板凝集试验抗原、标准阴性和阳性血清，来自青岛易邦生物工程有限公司；布鲁菌病试管凝集试验抗原、标准阴性和阳性血清，来自青岛易邦生物工程有限公司；补体结合试验抗原、标准阳性血清、阴性血清、溶血素和补体，由中国CDC传染病所提供；布氏杆菌抗体ELISA检测试验盒，由美国IDEXX公司提供。

1.3 主要仪器

酶标仪（TECAN，SUNRISE），瑞士TECAN公司产品；洗板机（Columbus M8/2R），瑞士TECAN公司产品；超纯水纯化系统（Milli-Q-B），美国密理博公司产品；电热恒温水浴箱（WS2-261-79），上海医用恒温设备厂；恒温培养箱（HPS-250），哈尔滨市东明医疗仪器厂；单、多道移液器（Eppendorf），德国Eppendorf公司生产；离心机（SIGMA，3K30），德国希格玛离心机有限公司生产。

1.4 试验方法

虎红平板凝集试验（RBT）、试管凝集试验（SAT）和补体结合试验（CFT）按照GB/T 18646-2002进行操作与判定，酶联免疫吸附试验（ELISA）试验按试剂操作说明书进行操作与结果判定。

表1 检测实验的可能结果

2 结果与分析

2.1 牛羊布鲁菌病不同血清学检测方法结果

按《布鲁氏菌病防治技术规范》要求，RBT阳性而SAT阴性或CFT阴性牛只需间隔30天重新采血检测，本试验过程中，出现的可疑牛只，间隔30-45天重新采集血清样本进行了检测，转阳的和仍然可疑的，按阳性统计，转阴的，按阴性统计，检测结果见表2、表3。

为了更好说明四种布鲁菌病检测方法的可靠性，研究中分别利用布鲁菌病ELISA检测结果与RBT、SAT和CFT检测结果分别进行比较，采用假阳性率、假阴性率、一致率和Kappa值四种分析指标。假设，实验中形成的检测结果如表1所示。

表2 ELISA与RBT、SAT和CFT检测同一批奶牛血清样本布鲁菌病结果

表3 ELISA与RBT、SAT和CFT检测同一批羊血清样本布鲁菌病结果

四种分析指标的计算方法如下：

假阴性率＝（c/e1）×100%

假阳性率＝（b/e2）×100%

一致率＝[（a+d）/n]×100%

Kappa 值 ={[（a+d）/n]-[（e1r1+e2r2）/n2]}/{1-[（e1r1+e2r2）/n2]}[3]

假阴性率是指确诊阴性用某种方法检测为阳性与此种方法检测所有阳性之和的百分比；假阳性是指确诊为阳性用某种方法检测为阴性与此种方法检测所有阴性之和的百分比；一致率是指确诊的阳性与阴性样本且与两种检测方法结果相一致的总和与所有检测样本的百分比；Kappa值是医学上常用和一种用于计数资料的一致性评测，是评价一致性的测量值。假阴性与假阳性能反应检测方法的敏感性和特异性，一致率是检测方法的相关程度，Kappa值是一致性检验的统计指标，一般认为，Kappa值≥0.75，说明已经取得相当满意的一致程度。若Kappa值＜0.4，则说明一致程度不够理想。

2.2 ELISA与RBT、SAT和CFT检测结果的相关性比较

通过RBT、SAT、CFT和ELISA四种血清学方法，对牛羊布鲁菌病检测结果的对比，可以得出：RBT、SAT、CFT与ELISA检测的一致率较高（88%以上），通过Kappa值检验，Kappa值均大于或等于0.75，说明四种检测方法具有很好的一致性，ELISA方法可以进行布鲁菌病的诊断定性。但RBT、SAT、CFT与ELISA相比，有一定的假阳性（1.22%～22.97%）和假阴性（2.59%～14.71%）（见表2、表3），假阳性的存在容易发生牛羊布鲁菌病的错判，假阴性率高表明检测过程中容易出现病畜漏网状况，不利于布鲁菌病的净化工作。SAT作为国标中布鲁菌病诊断定性的方法，在布鲁菌病检测中效果并不理想，CFT敏感性差，易漏检，而成为群体的潜在威胁。这四种血清学方法中，RBT操作简便，快速易行，有一定的敏感性和特异性，用于牛羊布鲁菌病初筛效果较好，CFT方法虽然操作复杂，但特异性好，用于阳性畜的扑杀最为合理，因此采用RBT进行初筛，用CFT与ELISA进行牛羊布鲁菌病联合诊断较为理想。

3 讨论

虽然对沈阳市2009—2014年牛羊布鲁菌病复核样本进行了研究，但样品存贮时间与来源是否具有代表性，需要在以后的研究中进行进一步的验证。牛羊布鲁菌病的血清学诊断方法种类较多，但目前还没有任何一种方法在敏感性、特异性以及操作简便、易行、快速等方面都是完美无缺的。在对383头奶牛样本检测过程中，发现有25头SAT可疑或阴性，而ELISA检测出现阳性，检出可疑样品，间隔一个月需重新采样检测，在随后的检测中发现，这25头新采集奶牛样本中有20头出现了SAT转阳的情况；在检测中也出现了5份样本RBT阳性SAT阴性，而CFT和ELISA阳性的情况。阳性畜的漏检，为病原菌的散布和疾病的蔓延提供了机会，阴性畜的误杀会造成不必要的经济损失。

鉴于这几种检测方法的符合率不高，建议在实际检测工作中，用两种或两种以上的方法配合检测。一般在进行大规模检疫时，为了降低繁重的工作量，先采用特异性较差但价格低廉、操作比较简便、敏感性较高的方法进行筛选，然后再用敏感性和特异性好的诊断方法进行复核。通过研究认为，应用RBT初筛较好，因为RBT具有敏感性高，操作简单易行，不需要太多的仪器设备，对环境要求不严格；布病的阳性畜要进行扑杀和无害化处理，因此运用特异性好的CFT与ELISA方法进行联合诊断定性较为理想。

[1]尚德秋.布鲁氏菌病再度肆虐及其原因[J].中国地方病防治杂志，2001，16（1）：29-34.

[2]范伟兴，钟旗，何倩倪，等.几种布鲁氏菌病血清学诊断方法的比较研究[J].中国动物检疫，2006，23（6）：31-33.

[3]王蓓.临床流行病学[M].南京：东南大学出版社，2004：251.