传染性造血器官坏死病毒液相芯片检测技术

尹伟力，林 超，刘 宁，贾 鹏，岳志芹，孙 涛，刘 荭

（1.山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，山东 青岛 266002；2.深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，广东 深圳 518000；3.烟台出入境检验检疫局，山东 烟台 264000）

传染性造血器官坏死病（infectious haematopoietic necrosis，IHN）又名大鳞大马哈鱼病毒病（Chinook salmon virus disease）、红大马哈鱼病毒病（Sockeye salmon virus disease）等[1]，是一种毒力很强能引起感染鱼类急性、全身感染的严重传染病。病原为传染性造血器官坏死病毒（infectious haematopoietic necrosis virus，IHNV），属弹状病毒科粒外弹状病毒属成员，可侵害多种淡水、海水养殖鱼类，对水产养殖业危害极大[2]。

IHN最早发现于二十世纪四十年代的北美洲鲑鱼养殖场[3]，随后迅速蔓延至欧洲[4]，1968年传入日本[5]，1988年传至我国，并在局部地区暴发[6]。该病被列入世界动物卫生组织水生动物疫病名录，我国将其列为二类动物疫病。

细胞分离是检测IHNV的“金标准”，但该方法操作复杂、检测周期长[7-8]。液相芯片技术是一种新型快速检测技术，该方法集流式细胞术、纳米荧光微球、荧光信号数字处理和传统化学发光技术为一体[9-13]，其优势在于所需检测样本量少，检测周期短，既可检测核酸也可检测抗体[14]。本试验采用RT-PCR检测方法与液相芯片检测技术结合，建立了IHNV的液相芯片快速检测方法，为IHNV检测提供了新手段。

1 材料与方法

1.1 毒株核酸

传染性造血器官坏死病毒（IHNV）、流行性造血器官坏死病毒（EHNV）、病毒性出血性败血症病毒（VHSV）和传染性胰脏坏死病毒（IPNV）核酸由深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心提供；鲤春血症病毒（SVCV）株由本实验室保存。

1.2 试剂与设备

表面羧基化的荧光编码微球、鞘液、甲基咪唑（TE）、碳二亚胺购自美国BD公司；TMAC（tetramethyl-ammonium chloride）、Tris、SDS（10%solution）、链霉菌抗生物素蛋白－藻红蛋白（SAPE）购自美国Sigma公司；SPAE Streptavidin-R-phycoerythrin购自美国Prozyme公司；RNA提取试剂盒（Takara MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.3.0）、RT-PCR试 剂 盒（RT-PCR Kit II）、DL2000 Marker购自大连宝生物公司。

主要设备：BD FACSArray液相芯片仪（美国BD公司）；Eppendorf Mastercycler Gradient梯度PCR扩增仪（德国Eppendorf公司）；AlphamagerTM2200凝胶成像系统（美国AP公司）；Eppendorf高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）等。

1.3 引物探针的设计

通过Internet登陆美国国家生物信息技术中心（NCBI），查询检索已公布的IHNV N基因序列（AY442518.1），利用Primer Premier5.0软件设计一对引物和探针，上、下游引物5’端进行生物素标记；探针5’端进行氨基化修饰（表1）。

表1 引物及探针序列

1.4 RT-PCR反应体系的建立

采用RNA提取试剂盒（大连宝生物公司）提取IHNV RNA。RT-PCR扩增的反应体系：在0.2mL PCR反应管中，依次加入10×RT-PCR buffer 2.5mL、dNTP（各 2.5mmol/L）2.5mL、10pmol/mL F10.5mL、10pmol/mL R10.5mL、Inhibiter 0.5mL、AMV XL 0.5mL、AMV Taq（5U/mL） 0.5mL、25mmol/L MgCl25.0mL、总 RNA 3.0mL，加入双蒸水使反应体积达到25mL。以上反应体系中，除了引物、总RNA和双蒸水，其它组分均为RT-PCR试剂盒的组分。RT-PCR反应程序：50℃ 30min；94℃ 2min；然后 94℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 30s，30个循环；最后72℃延伸5min，4℃保温。

扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳，在紫外凝胶图像分析系统上观察、分析扩增产物。

1.5 液相芯片检测体系的建立

1.5.1 寡核苷酸探针与微球共价偶联

①将微球漩涡混合20s充分分散；取3×106个微球（75mL），于1.5mL离心管中10000×g离心1min，去上清；

②加入50mL 0.1mol/L甲基咪唑溶液（ph4.5），漩涡混合，超声波处理（0.5-1min）；

③加入氨基化探针1.0nmol，漩涡混合；

④加入2.5mL碳二亚胺溶液（10mg的碳二亚胺粉末加入1.0mL的灭菌纯水，现用现配）充分混匀，室温避光孵育30min；

重复④一次。加入1.0mL 0.02% Tween-20，混匀，10000×g离心1min，弃上清；加入1.0mL 0.1% SDS，混匀，10000×g离心1min，弃上清；

用0.1mol/L甲基咪唑溶液（pH 4.5）100mL 重悬微球，2～8℃避光保存，待用。

1.5.2 杂交

杂交体系包括：1.5mL探针偶联微球、33mL 1.5×TMAC 杂 交 液、14.5mL TE、2.5mL RT-PCR产物，空白孔以5mL TE取代PCR产物。混合均匀后于98℃变性10min，在52℃温度下孵育15min，18000×g离心 2min 去上清；加入 50 mL用1×TMAC 杂交液稀释的SA-PE（1：500），选定温度下孵育10min，18000×g离心2min 去上清；加入50mL 1×TMAC 杂交液，漩涡混合使微球重悬，上机分析。

杂交温度的优化，杂交反应时间在15min条件下，根据探针的Tm值，选48℃、50℃、52℃、54℃、56℃等5个温度梯度为研究对象，考察不同杂交温度下液相芯片的检测效果。

1.6 液相芯片检测体系重复性分析

将IHNV的RT-PCR产物用于液相芯片检测试验，做3个重复，计算变异系数。

1.7 液相芯片检测体系特异性分析

将IPNV、SVCV、IHNV、EHNV、VHSV的RT-PCR产物或PCR产物，用液相芯片检测体系进行检测，判断整个液相芯片检测体系对非目标物有无检测信号。

1.8 液相芯片检测体系灵敏度分析

将IHNV病毒核酸进行系列稀释，得到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8稀释度的模板RNA，用建立的液相芯片体系进行反应，检测方法的灵敏度。

1.9 样本检测

用建立的方法对30份实验室保存的样品进行检测，与世界动物卫生组织《水生动物疫病诊断手册》推荐的RT-PCR法[15]比较，评价其准确性。

2 结果

2.1 RT-PCR体系的建立

将IHNV RNA作为模板进行RT-PCR扩增，产物经2%琼脂糖凝胶电流分析，结果显示扩增出大小为126bp左右的目的条带，与预期扩增的片段大小一致（图1）。

图1 IHNV RT-PCR电泳结果

2.2 液相芯片检测体系的建立

2.2.1 杂交温度的优化

参与计数的荧光编码和微球均在100个以上（图2a），表明用于计算的荧光编码微球数量有效，所产生的荧光强度中位值（MFI）可信，3个荧光编码微球的空白对照MFI值均小于500，试验可进行结果判断。试验结果表明48℃～56℃之间，荧光变动幅度都不大，显示52℃杂交良好，高于54℃时，检测荧光下降剧烈，因此最佳杂交温度选为52℃。

2.2.2 液相芯片检测体系的确立

液相芯片定性比值结果（LQRR）等于样品校正后的MFI值（MFIS）与空白对照MFI平均值（MFIB）的比值，即LQRR＝MFIS/MFIB。如果LQRR≥3，判定为阳性样本；如果2≤LQRR＜3，则判定为可疑；如果LQRR＜2，则判定为阴性。参与计数的荧光编码微球均≥100个，表明用于计数的荧光编码微球数量有效，所产生的MFI值可信，各个荧光编码微球的空白对照MFI均＜500，表明结果有效，试验可以进行结果判定。从图2b、2c、2d看出，偶联微球的探针与IHNV RT-PCR产物在Red-A、Yellow-A检测通道下均有荧光信号，表明IHNV液相芯片构建成功。

图2 IHNV液相芯片检测结果

2.3 液相芯片检测体系的重复性分析

将提取的IHNV RNA进行RT-PCR扩增，然后在相同的反应条件下进行液相芯片体系进行三次检测，计算各批次间检测的平均荧光强度值的变异系数，结果显示变异系数小于4%，表明该方法具有良好的重复性。

2.4 液相芯片检测体系特异性分析

分别以SVCV、IHNV、EHNV、VHSV和IPNV的RT-PCR产物或PCR产物模板，进行液相芯片检测。结果（表2）表明，对目标病毒的检测结果均为阳性，而对非目标病毒的扩增产物的检测值均为阴性，表明所建立的方法具有很好的特异性。

2.5 液相芯片检测体系灵敏性验证

将IHNV 病毒核酸进行10倍系列稀释，得到10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1等 不同稀释度的稀释液，用已经建立的液相芯片检测体系进行检测，灵敏度检测结果如表3，检测IHNV最低检测限为100pg。

表2 液相芯片检测体系特异性验证

表3 液相芯片检测体系灵敏度验证

2.6 样本检测

对30份实验室保存的样品检测结果显示，5份样品为阳性，该法与OIE推荐的RT-PCR方法检测结果基本一致，但RT-PCR检测结果中有2份阳性样品电泳谱带较弱，较难辩别。液相芯片法比PCR要灵敏（表4）。

3 讨论

本研究建立了传染性造血器官坏死病毒的液相芯片快速检测技术，可应用于快速检测水生动物疫病、进行流行病学调查等工作。

与传统检测方法相比，液相芯片技术集合了核酸扩增、液相微球杂交、激光等诸多检测技术，具有快速、简便、高通量等优点[16]。杂交与检测过程中无需繁琐的洗涤步骤，且整个反应都在同一密闭反应管中进行，避免了开盖的交叉污染。与固相芯片相比，由于采用了流式悬浮微球杂交技术，其反应更为高效，操作也更为灵活。与常规PCR方法相比，由于液相芯片检测体系通过激光检测核酸杂交微球的集合体，有效避免了多种核酸扩增产物的相互干扰，提高了灵敏度。

表4 液相芯片检测体系与PCR对样品检测结果的比较

液相芯片检测的技术关键是设计多重扩增引物与探针[17]。本研究通过比对不同IHNV毒株的基因组序列，初步筛选多种引物，通过反复优化，选定适合检测IHNV的引物。在优化探针实验中发现，G、C碱基含量应该在40～60%，过少不易与PCR产物杂交，过多则会出现特异性杂交。探针内部的互补序列如果超过4个碱基则会出现发夹结构。此外，探针的每个碱基必须与扩增产物一一配对，因此，在设计探针时应选择IHNV高度保守的序列。

在方法建立过程中，本研究对杂交温度选择、碳二亚胺溶液浓度、探针与微球偶联次数等进行了探索。通过多次实验，发现杂交温度的主要根据探针Tm值而确定，一般选择Tm值上下各6℃范围进行摸索。碳二亚胺溶液最合适浓度为10mg/mL，低于此浓度会影响偶联。探针与微球偶联次数在2～3次较为合适，如果偶联不成功可以增加次数，但不要超过5次，否则本底值过高，会影响结果。同时研究表明，在分析结果时，首先要圈定微球范围（如图2a），尽量圈定微球集中地区域，分散于其他位置的微球可以忽略不计，否则会造成结果的偏差。

由本实验中对30样品临床检测结果可知，液相芯片检测结果与传统PCR方法基本一至，但PCR检测结果中有2份样品电泳带较弱，肉眼较难辩别，而液相芯片检测结果为阳性，说明灵敏度比传统PCR方法高。所建立的液相芯片检测体检测IHNV最低限量为100pg。

本方法能够对传染性造血器官坏死病毒进行快速检测，从样品处理到出结果仅需2.5小时左右。由于采用了接近生物反应体系的液相芯片系统和特异性的探针，使该方法的特异性高于传统检测方法，大大杜绝了非特异性扩增造成的假阴性结果。采用了液相反应体系，使该方法灵敏度高于PCR，避免了PCR检测中溴化乙锭对人员和环境的污染，非常适合对进出境水生动物进行高通量检测。

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