葡萄二倍体与四倍体杂交胚挽救技术中珠被处理方式的研究

陈三春 ，张 娜 ，武书哲 ，田淑芬

（1.天津师范大学生命科学学院，天津 300387；2.天津市农业科学院葡萄研究中心，天津 300192；3.天津市葡萄遗传与育种企业重点实验室，天津 300192）

选育优质无核葡萄是现代葡萄育种的研究热点。20世纪80年代以前的无核品种中，70%左右都是通过有性杂交获得的，即以无核品种做父本，有核品种做母本杂交组合中选育出来的，这种选育无核葡萄品种的方式预选困难且效率低下。1982年美国育种学家Ramming和Emershad[1]改变了传统育种模式，创立了无核胚挽救技术，利用胚挽救技术，虽然可以进行无核与无核品种之间的杂交，但亲本选择范围较小。三倍体育种为无核葡萄育种开辟了新途径，即采用二倍体和四倍体杂交获得三倍体后代，三倍体具有高度不育性，从而提高后代无核效率，三倍体育种是获得大粒无核葡萄的重要育种途径，但仍存在着植株形成率低，技术不完善等问题。

本研究以玫瑰香优系（欧亚种，二倍体，该优系适应性强、丰产、抗病性强，天津市农科院葡萄研究中心通过分子标记和田间选种结合的方法鉴别筛选出，较普通玫瑰香品种香气浓郁，果穗松紧度适中，果粒均匀）为母本，以户太8号和巨峰为父本，通过杂交进行玫瑰香型大粒无核葡萄的筛选，研究取样时期、剥胚和剪喙不同处理方式对两种杂交组合胚挽救的影响，为三倍体育种技术提供参考。

1 试材与方法

1.1 试验材料

试验于2014～2015年在天津市农业科学院葡萄研究中心、天津市葡萄遗传与育种企业重点实验室进行。供试材料为玫瑰香与户太8号杂交胚珠、玫瑰香与巨峰杂交胚珠。

1.2 方法

在初花期采集父本的花粉，花前3～4d母本去雄，柱头上开始分泌粘液时授粉，以24h为间隔连续授粉3次。自葡萄授粉后35d起，每隔10d调查1次胚珠发育状况，即随机取15粒果实，称其浆果单粒重，然后剥开果实取出胚珠，称取胚珠的平均重量并统计浆果内平均胚珠数，连续取样3次，将取样果粒在自来水中洗净后，置于超净工作台上，先用75%的酒精浸泡45s，无菌水冲洗1次，再在3%的次氯酸钠溶液中浸泡3min，无菌水冲洗3次。切开浆果，取出胚珠，接种在培养基上。

1.2.1 杂交果实胚珠重量、胚珠数量变化观察

取玫瑰香×户太8号、玫瑰香×巨峰葡萄授粉后35、45、55d的果粒，每个取样时期随机选取15粒果实，称其浆果单粒重，然后剥开果实取出胚珠，称取胚珠的平均重量并统计浆果内平均胚珠数，并进行统计比较。

1.2.2 不同接种时间对胚发育的影响

取玫瑰香×户太8号、玫瑰香×巨峰葡萄授粉后35、45、55d的杂交胚珠在胚珠发育培养基上培养60d后进行剥胚处理，调查胚发育的情况，并进行统计比较。

1.2.3 不同培养方式对幼胚萌发率的影响

分别取授粉后45d和55d玫瑰香×户太8号、玫瑰香×巨峰杂交胚珠在发育培养基上培养60d后，分别进行剥胚和剪喙处理，转入胚萌发培养基，并统计胚萌发率、成苗率以及畸形苗率。

胚珠培养采用的ER培养基（0.5mg/L 6-BA，30g/L蔗糖，1g/L活性炭，pH5.8，5g/L琼脂）。胚萌发过程中采用剥胚和剪喙两种处理方法，在WPM培养基（0.2mg/L6-BA，30g/L蔗糖，1g/L活性炭，5g/L琼脂，pH5.8）上培养，30d后调查胚成苗情况。

分别统计接种胚珠数、胚发育率、胚萌发率、胚成苗率和畸形苗率，计算方法如下：

胚发育率=（发育胚数/接种胚珠数）×100%；胚萌发率=（萌发胚数/接种胚珠数）×100%；成苗率为=（正常苗数/萌发胚数）×100%；畸形苗率（畸形苗数/萌发胚数）×100%。

2 结果与分析

2.1 杂交果实胚珠重量、胚珠数量变化观察

由表1可以看出：在授粉后35～55d，随着取样时间延迟，玫瑰香×户太8号杂交果实平均重量持续增加，而杂交胚珠平均重量则呈先减后增趋势，单粒浆果内平均胚珠数逐渐减少。玫瑰香×巨峰杂交果实平均重量先增后减，杂交胚珠重则呈先减后增趋势，单粒浆果内平均胚珠数逐渐减少。

表1 不同接种时期果实重、胚珠重及胚珠数的观察

2.2 不同接种时间对胚发育的影响

由表2可以看出：随取样时间的延迟，玫瑰香×户太8号、玫瑰香×巨峰胚珠内胚发育率总体呈增长趋势，在授粉后55d胚发育率均达到最高；在授粉后45～55d，两个杂交组合胚珠内胚发育率呈明显上升趋势。在相同的采样时间，玫瑰香×户太8号胚发育率均高于玫瑰香×巨峰，不同的父本基因型对胚发育率也有一定的影响。

表2 不同取样时期对胚发育率的影响

2.3 不同培养方式对幼胚萌发率的影响

由表3可以看出：不同取样时间，玫瑰香×户太8号胚珠内胚萌发率剥胚处理高于剪喙处理，而玫瑰香×巨峰胚珠内胚萌发率剥胚处理低于剪喙处理；两个杂交组合的成苗率剪喙处理均高于剥胚处理，畸形苗率则是剥胚处理均高于剪喙处理；随着取样时期推迟，两个杂交组合的剥胚处理胚萌发率、成苗率均上升，畸形苗率下降；玫瑰香×户太8号剪喙处理胚萌发率、成苗率先升高后降低，玫瑰香×巨峰胚萌发率升高，成苗率则先升高后降低；在胚挽救过程中，两个杂交组合，采取剪喙处理杂交胚更容易获得正常苗，因此剪喙为较好的处理方式；玫瑰香×户太8号和玫瑰香×巨峰在授粉后45d经剪喙处理更容易获得正常苗，因此授粉后45d为较好的取样时期。

表3 不同处理方法对胚萌发胚成苗的影响

3 讨论与结论

确定胚珠接种的最佳时间是胚挽救成功的前提。关于葡萄二倍体与四倍体的取样时间，Yamashita等[2-3]和Okamoto等[4]报道的时间基本集中在授粉后50～70d。徐海英等[5]研究表明葡萄二倍体与四倍体杂交胚发育进程与无核品种有显著不同，同一品种内存在果粒大小不整齐及同一果实中胚珠发育程度不一致现象，根据胚珠重量绘出的胚珠生长曲线有些表现呈无规则，葡萄二倍体与四倍体杂交胚珠败育是渐进性的，发生败育的时间与母本成熟期有明显的关系，不同倍性的有核品种间杂交胚珠的败育存在明显的个体间差异。本研究中两个杂交组合果实重和胚珠重表现有些无规则，而从胚珠数呈持续降低趋势可以看出，在授粉后35d起，两组杂交组合胚珠败育逐渐增强。

葡萄的外种皮对于发育不完全胚存在着机械阻碍[6]，影响胚的萌发。众多研究学者认为，对葡萄珠被进行一定的处理，可以提高无核葡萄胚的萌发及成苗率。Fernandez[7]对无核与无核杂交胚珠分别采用了3种珠被处理方式，直接进行胚珠培养获得幼苗，对于胚珠进行切喙处理，剥取裸胚进行胚萌发培养。结果显示：剥取裸胚萌发率显著高于其他两种处理，最高可达67%。而经过切喙和胚珠直接培养胚萌发率仅为0～15%，E－mershad[8]、Ramming[9]、Spigel-Rol[10]、Cain[11]等采用胚珠培养再剥取裸胚培养来提高无核葡萄的胚挽救成功率。郭印山等[12]对二倍体与四倍体葡萄杂种胚珠采取横切的方法获得了三倍体植株，郭海江、王跃进等[13]采取剥取裸胚的方法获得了大量的杂种后代。孟新法等[14]研究发现剥取裸胚，可以使胚萌发提前，萌发整齐，提高成苗质量，并且能直接判断最后的成苗是合子胚还是体细胞胚。蒋爱丽等[15]研究认为：尽管采取剥胚得到的有胚率为最高，但是由于操作中易碰伤及其他原因，畸形苗占相当比例，所得正常的试管苗比不剥胚的还略低些。

本研究以玫瑰香×户太8号、玫瑰香×巨峰杂交胚珠为试材，研究发现两组杂交组合授粉后35d起，胚珠败育逐渐增强，在授粉后55d取样，胚发育率最高；经剪喙处理过的杂交胚珠成苗率高且畸形苗率低。在胚挽救过程中，两个杂交组合，采取剪喙处理杂交胚更容易获得正常苗，因此剪喙为较好的处理方式；玫瑰香×户太8号和玫瑰香×巨峰，在授粉后45d经剪喙处理更容易获得正常苗，因此授粉后45d为较好的取样时期。

［1］Ramming D W，Emershad R L.In-ovule embryo culture of seeded and seedless［J］.V.vinifera L.Horticultural Science，1982，17（3）：487.

［2］Yamashita H，Haniuda T，Shiba H.In vitro culture of embryos obtained by crossing tetraploid grape cultivar‘Kyoho’ with diploid cultivars ［J］.Journalofthe Japanese Society for Horticultral Science，1995，63（4）：719-724.

［3］Yamashita H，Horiuchi S，Taira T.Development of seeds and growth of triploid seedlings obtained from reciprocalcrossesbetween diploidsand tetraploids grapes［J］.Journal of the Japanese Society for Horticultral Science，1993，62（2）：249-255.

［4］Okamoto G，Hirano K，Tanakamaru N，Omori N.Obtaining triploid muscatgrapesby in vitro culture of ovulesand embryosafter crossing between diploid and tetraploid cultivars［J］.Scientific Reports of the Faculty of Agriculture ，Okayama University，1993，82：25-29.

［5］徐海英，闫爱玲，张国军.葡萄二倍体与四倍体品种间杂交胚挽救取样时期的确定［J］.中国农业科学，2005，38（3）：629-633.

［6］刘佳，刘晓，陈建，等.金星无核葡萄胚挽救影响因素的研究［J］.西南农业学报，2013，26（1）：294-298.

［7］Fernandaz，J.N.MOORE.Effect of seedcoat manipulation on the germination ofstenospermocarpic grape embryos cultured in ovule［J］.Hortscience.1991，26（9）：1220.

［8］EmershadR.L.，RammingD.W.，SerpeM.D..Inovule embryo development and plant formation from stenospermic genotypes of vitis vinifera ［J］.Amer.J.Bot.，1989，76（3）：397-402.

［9］Ramming D.W.，Lu J.，Lamikanra O.，et al.Developing seedless grapes by embryo rescue［J］.Proc Vitis Symp.1995，18：26-30.

［10］Spiegle-Roy，Sahar P N，Baron J，et a1..In vitro culture and plant formation from grape cultivars with abortic ovules and Seeds［J］..Amer Soc.-Hort.-Sci..1985，110：109-112.

［11］Cain D.W.，Emershad R.L.，Tarilo R.E..In-ovule embryo culture and see dlingdevelopmentofseeded and seedless grapes（V.vinifera L.）［J］.Vitis.1983，22：9-14.

［12］郭印山，陈文玲，郭修武，等.二倍体与四倍体葡萄品种杂交胚挽救及后代倍性鉴定［J］.沈阳农业大学学报，2014，（3） .

［13］郭海江，王跃进，张剑侠.葡萄抗病无核胚挽救育种及分子标记辅助选择［J］. 西北植物学报，2005，（12）：2395-2401.

［14］孟新法，张利，张潞生，等.无核葡萄胚发育及早期离体培养的研究：III.接种方式对离体胚发育的影响［J］.北京农业大学学报，1992，18（4）：393-395.

［15］蒋爱丽，李世诚，金佩芳，等.大败育型无核葡萄胚珠培养成苗技术研究［J］.上海交通大学学报（农业科学版），2002，20（1）：45-48.