响应面法优化火棘果中多酚提取工艺

吴　伟，李　格，向　福*（1.大别山特色资源开发湖北省协同创新中心，湖北 黄州 438000；.湖北理工学院医学院，湖北 黄石 435003；3.黄冈师范学院生命科学学院，湖北 黄州 438000）

响应面法优化火棘果中多酚提取工艺

吴伟1，2，李格2，向福1，3*
（1.大别山特色资源开发湖北省协同创新中心，湖北 黄州 438000；2.湖北理工学院医学院，湖北 黄石 435003；3.黄冈师范学院生命科学学院，湖北 黄州 438000）

以火棘果为原料，乙醇溶液为溶剂提取其中的多酚类化合物。通过对火棘果多酚提取的单因素试验，并根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，进行3因素3水平的响应面分析试验，得出火棘果中多酚的最佳提取条件为：乙醇体积分数70%，提取温度70℃，料液比1∶20（g∶mL），提取时间4.0 h，提取次数3次。在此条件下进行3次验证试验，得出火棘果多酚提取率的平均值为2.84%，与回归方程得出的理论数值2.85%基本相符。该研究为大别山区火棘果资源的综合利用提供了理论依据。

火棘果；多酚；提取；响应面分析法

火棘（Pyracantha fortuneana）是蔷薇科常绿野生灌木或小乔木植物，共有10种，广泛分布于亚洲东部至欧洲南部。我国已发现7种，常见的为火棘、窄叶火棘、细圆齿火棘、全缘火棘4种，其中分布最广、产量最大的为火棘，又叫救军粮、火把果、赤阳子等，主要分布于中国黄河以南及西南地区，包括陕西、浙江、广西、云南、贵州、四川、湖北等省份［1］，其中贵州的鲜果年产量达到2 500万公斤以上，而湖北甚至年产量达到1亿公斤［2-3］。大别山区火棘果资源非常丰富，如何更好的综合利用火棘果资源，提高产品附加值，将对该地区的其他特色资源的开发利用提供参考与借鉴。

植物多酚是一类广泛存在于植物体内的多元酚类化合物，具有芳环结构并结合有一个或多个羟基［4-5］。它是植物的次生代谢产物，主要存在于植物的皮、根、茎、叶和果实中，在自然界中的资源十分丰富。狭义的看，可以认为植物多酚指的是鞣质或单宁，其分子质量为500～3 000 u；广义的看，它还包括了小分子酚类化合物，如各种黄酮类化合物［6］、没食子酸、儿茶素、花青素、鞣花酸和熊果苷等天然酚类［7-8］。近年来，随着多酚类物质抗病原微生物、抗肿瘤、延缓机体衰老、以及抗氧化等生物活性功能的发现，使其在食品、医药、化妆品、日用化学品及保健品等领域得到广泛关注。但对火棘果的研究主要集中在营养成分，功效方面，对其有效成分如多酚的有效提取少有报道。本研究利用响应面优化试验对火棘果多酚提取工艺进行探讨，为充分利用大别山区的火棘果资源提供便利。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

火棘果：采自湖北省罗田县。

没食子酸标准品（色谱纯）：上海金穗生物科技有限公司；钨酸钠、钼酸钠（均为分析纯）：天津市东丽区天大化学试剂厂；硫酸锂、结晶碳酸钠、石油醚（均为分析纯）：天津市凯通化学试剂有限公司；无水乙醇（分析纯）：武汉市洪山中南化工试剂有限公司；浓磷酸（分析纯）：深圳市琪运达化工有限公司；浓盐酸（分析纯）：中平能化集团开封东大化工有限公司。

1.2仪器与设备

RE-3000旋转蒸发器、SHZ-Ⅲ循环水真空泵：上海亚荣生化仪器厂；AL204电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；SF-130C万能粉碎机：吉首市中诚制药机械厂；752SP型紫外-可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；HWS26水浴锅：上海一恒科技有限公司；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱：上海姚氏仪器设备厂。

1.3试验方法

1.3.1火棘果的预处理

将火棘果用清水漂洗，除去泥沙、尘土等杂质，在60℃条件下进行烘干处理。然后将干燥的火棘果粉碎。最后将火棘果粉末用石油醚在60℃条件下回流1 h，再干燥备用。

1.3.2Fo1in-Cioca1teau试剂的配制

称取80 g的钨酸钠和20 g的钼酸钠置于圆底烧瓶中，用560 mL的去离子水溶解后，加入85%的磷酸溶液40 mL 和80 mL的浓盐酸，用文火回流10 h，然后加入12 g的Li2SO4及60 mL的H2O2，加热沸腾15 min至试剂呈亮黄色，不得带微蓝和绿色，冷却后，移入1 000 mL的容量瓶中，定容，贮于棕色瓶中［9-10］。

1.3.3没食子酸标准曲线的绘制

在减压干燥箱中，将没食子酸标准品减压干燥至质量恒定，于万分之一分析天平精密称取没食子酸标准品25mg，用去离子水溶解并定容到250mL的容量瓶中，得0.1mg/mL的标准品母液。精密吸取母液0、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL于50 mL容量瓶中，加入5 mLFo1in-Cioca1teu试剂，摇匀后再加入10mL20%Na2CO3溶液，用去离子水定容至50mL，即得0、0.001mg/mL、0.002mg/mL、0.003mg/mL、0.004 mg/mL、0.005 mg/mL的标准对照溶液。室温下反应2 h后，测定其在波长760 nm处的吸光度值，以没食子酸标准品质量浓度（C）为横坐标，吸光度值（A）为纵坐标绘制没食子酸标准曲线，即得回归方程A=171.06C+0.012 5，R2= 0.9962，表明质量浓度为0～0.005mg/mL时线性关系良好。

1.3.4火棘果多酚的提取

准确称取火棘果粉末1 g于圆底烧瓶中，以一定的料液比，加入一定体积分数的乙醇溶液，在一定温度下，回流提取一定的时间和次数，然后抽滤得滤液，浓缩，定容于100mL的容量瓶中为样品溶液。精密吸取样品溶液2.5mL于25mL的容量瓶中，加入2.5 mL Fo1in-Cioca1teu试剂，摇匀后再加入5mL20%Na2CO3溶液，用去离子水定容至25mL，室温下反应2 h后，测定其在波长760 nm处的吸光度值，得到火棘果多酚质量浓度，并计算多酚提取率，其计算公式如下：

1.3.5单因素试验

提取方法见1.3.4，分别考察乙醇体积分数（65%、70%、75%、80%、85%、90%）、提取温度（60℃、65℃、70℃、75℃、80℃）、料液比（1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35）（g∶mL）、提取时间（2.5 h、3.0 h、3.5 h、4.0 h、4.5 h）和提取次数（1、2、3、4、5）对火棘果多酚提取率的影响。

1.3.6响应面分析试验

根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理［11］，综合考虑单因素试验的结果，以多酚提取率（Y）为响应值，采用3因素3水平的响应面分析方法，设计响应面试验，试验因素与水平设计见表1。

表1响应面设计因素和水平Table 1 Factors and levels of central composite design

1.3.7验证试验

为了验证响应面分析法得到的模型和回归方程的准确性。根据响应面分析法得到的最优条件以及考虑实际操作的便利性后确定最终条件，在最佳条件下进行3次平行试验。

2　结果与分析

2.1单因素试验

2.1.1乙醇体积分数对多酚提取率的影响

图1　乙醇体积分数对多酚提取率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on polyphenol extraction efficiency

在提取温度70℃，提取时间4.0 h，料液比1∶20（g∶mL），提取次数3次的条件下探索不同乙醇体积分数对多酚提取率的影响，其结果如图1所示。由图1可知，当乙醇体积分数从65%上升到70%时，多酚的提取率增大，但当乙醇体积分数＞70%时提取率减小。其原因可能是高浓度乙醇使醇溶性杂质、色素、亲脂性强的成分溶出量增加［12］，导致干扰因素的增加，使纯化过程更加困难。因此，体积分数70%的乙醇最合适。

2.1.2提取温度对多酚提取率的影响

在乙醇体积分数70%，提取时间4.0 h，料液比1∶20 （g∶mL），提取次数3次的条件下探索不同提取温度对多酚提取率的影响关系，其结果如图2所示。由图2可知，当温度为60～70℃时，多酚的提取率稳步上升；温度70℃时提取率达到峰值；70～80℃时提取率开始下降。这种现象可能原因为随着温度升高，溶剂黏度下降且分子运动加速，这导致多酚的扩散系数增大，使其溶解度增加。但是，高温能促进多酚的氧化转化，使其提取率下降。因此，提取温度70℃最合适。

图2　提取温度对多酚提取率的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on polyphenol extraction efficiency

2.1.3提取时间对多酚提取率的影响

图3　提取时间对多酚提取率的影响Fig.3 Effect of extraction time on polyphenol extraction efficiency

在乙醇体积分数70%，提取温度70℃，料液比1∶20 （g∶mL），提取次数3次的条件下探索不同提取时间对多酚提取率的影响，其结果如图3所示。由图3可知，当提取时间为2.5～3.5 h时，提取率的变化相对平稳；在3.5～4.0 h时，稳步上升；在4.0 h时达到峰值；当提取时间超过4.0 h，提取率急剧下降。其原因可能是在一定的范围内，提取时间越长，乙醇与火棘果粉末相互作用的时间越长，因而提取率增加，但当两者达到平衡后，若再延长提取时间其他杂质也会被提取出来，使多酚相对含量减少［13］。因此，提取时间为4.0 h最合适。

2.1.4提取料液比对多酚提取率的影响

在乙醇体积分数70%，提取温度70℃，提取时间4.0 h，提取次数3次的条件下探索不同料液比对多酚提取率的影响，其结果如图4所示。由图4可知，多酚的提取率随提取液使用量的增加呈现先增加后下降的趋势。当提取料液比为1∶20（g∶mL）时，提取率达到最大。其可能原因是由于浸提液较多，旋转蒸发时间较长，造成多酚类化合物损失一部分［14］。同时，料液比过大也会造成乙醇溶剂和能源的浪费。因此，本试验中料液比为1∶20（g∶mL）最合适。2.1.5提取次数比对多酚提取率的影响

图4　料液比对多酚提取率的影响Fig.4 Effect of solid to liquid ratio on polyphenol extraction efficiency

在乙醇体积分数70%，提取温度70℃，提取时间4.0 h，料液比1∶20（g∶mL）的条件下探索不同提取次数对多酚提取率的影响，其结果如图5所示。由图5可知，多酚的提取率随提取次数的增长呈现先增加后平缓的趋势。当提取次数高于3次时，提取率增加不明显，从提取效果和降低成本等方面综合考虑，提取3次比较合适。

图5　提取次数对多酚提取率的影响Fig.5 Effect of extraction times on polyphenol extraction efficiency

2.2响应面优化试验

2.2.1响应面试验结果

利用Design-Expert V8.0.6.1中Box-Behnken模型，按照表1中的因素水平进行试验。以X1（提取温度）、X2（乙醇体积分数）、X3（料液比）为自变量，以火棘果多酚提取率为响应值（Y），响应面试验设计及结果见表2。

表2响应面试验分析结果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

由于各因素对多酚提取率的影响不是简单的线性关系，为了更明确各因素对响应值的影响，采用Design-Expert V8.0.6.1软件，对表3中火棘果多酚提取率试验数据进行多元回归拟合，得到多酚提取率（Y）对提取温度（X1）、乙醇体积分数（X2）、料液比（X3）的回归方程为：

模型的可靠性可以从方差分析和相关系数来考察。利用Design-Expert软件对表2中数据进行方差分析，分析结果见表3。由表3可知，X2、X1X2和X1X3对响应值有显著影响；X1、X3、X12、X22和X32对响应值极显著。此外，F值的大小也反应了各因子对响应值影响的强弱，F值越大，表明该因子对响应值的影响越强。而F（X1）＞F（X3）＞F（X2）表明所选的3个因素中，提取温度对多酚提取率影响最大，料液比次之，乙醇体积分数相对最小。整体模型极为显著（P值＜0.000 1），说明各次试验的该模型的预测值与实测值比较相符的；失拟项不显著（P=0.367 6＞0.05），说明该模型失拟项不显著，即该模型对于实验数据的拟合度较好。其相关系数R2=0.997 8，R2Adj=0.995 1，也说明该模型拟合程度较好，其响应值数据的变化有99.51%来自于所选变量，即来源于乙醇体积分数、提取温度、提取料液比。因此，可以用此模型对火棘果多酚的提取进行分析和预测。

表3响应曲面二次回归方程模型方差分析Table 3 Analysis of variance of Box-Behnken experiments

2.2.2因素间的交互影响

响应面图形是响应值对各因素X1、X2、X3所构成的三维空间的曲面图。将一个因素设为中心值，描绘出对应两因素的三维响应面图，能直观考察各因素对火棘果多酚提取率的影响及各因数之间的相互作用。等高线的形状可反映出交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反［15］。

采用Design Expert V8.0.6.1软件依回归方程式绘制响应面图及等高线，结果见图6。由图6可知，提取温度和料液比对火棘果中多酚提取率的影响最为显著，表现为曲线变化幅度较大；其次是乙醇体积分数，表现为曲线变化幅度平缓，这与方差分析的的结果一致。等高线的形状可反映出交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反。比较3组图可知，乙醇体积分数和提取温度之间的交互作用最为显著，表现为等高线呈椭圆形；相比较而言，提取温度和料液比之间的交互作用次之；乙醇体积分数和料液比之间的交互作用不显著，表现为等高线呈圆形。

图6　乙醇体积分数、提取温度、料液比交互作用对多糖提取率影响的响应曲面和等高线Fig.6 Response surface plots and contour line of effect of interaction between ethanol concentration，extraction temperature，liquid-solid ratio on polyphenol extraction efficiency

2.3验证试验结果

为确定各因素的最佳取值，利用Design Expert软件进行多元回归模型预测，得到的最佳提取工艺条件为：乙醇提取体积分数70.55%，提取温度69.54℃，提取料液比1∶21.21（g∶mL），该条件下多酚提取率预测值为2.85%。为了检验试验结果与理论情况是否一致，并考虑实际操作条件，在提取温度70℃，乙醇体积分数70%，提取料液比1∶20 （g∶mL），提取时间4.0 h，提取次数3次的条件下进行3次平行试验，得出实际多酚提取率为2.84%。验证值略低于预测值，说明采用响应面法优化得到的多酚提取条件可靠。

3　结论

建立了一个以火棘果多酚提取率为目标值，以乙醇体积分数、提取温度和料液比为评价因素，多酚提取率为评价指标，建立响应面模型。方差分析结果表明该模型拟合较好。通过DesignExpert软件对回归方程进行优化计算，得到最佳提取工艺条件：乙醇体积分数70%，提取温度70℃，料液比1∶20（g∶mL）。回归模型可较好的预测火棘果多酚的提取率，为综合利用火棘果资源提供了依据。为了验证试验结果的准确性，采用上述最佳提取条件进行3次验证试验，并得到的平均多酚提取率为2.84%，与预测值2.85%基本相符，说明响应面优化法对火棘果多酚提取条件的优化是可行的。该研究也为大别山区其他特色资源的综合利用提供了一定的借鉴。

［1］蒋利华，熊远福，李霞，等.野生火棘果有效成分研究进展［J］.中国野生植物资源，2007，26（2）：8-10.

［2］侯建军，魏文科，薛慧，等.野生植物火棘的研究进展［J］.湖北民族学院学报：自然科学版，2002，20（1）：15-18.

［3］黄祖良，韦国锋，何有成，等.桂西火棘果实特性和营养成分的研究［J］.食品研究与开发，2004，25（2）：75-76.

［4］庞道睿，刘凡，廖森泰，等.植物源多酚类化合物活性研究进展及其应用［J］.广东农业科学，2013，40（4）：91-94.

［5］宋立江，狄莹，石碧.植物多酚研究与利用的意义及发展趋势［J］.化学进展，2000，2（2）：161-170.

［6］冯涛，杨容，李越敏，等.苹果多酚提取物抗氧化活性研究［J］.食品研究与开发，2008，29（12）：189-192.

［7］牛鹏飞，仇农学，杜寅.苹果渣中不同极性多酚的分离及体外抗氧化活性研究［J］.农业工程学报，2008，3（3）：238-242.

［8］姚瑞祺.植物多酚的分类及生物活性的研究进展［J］.农产品加工：学刊，2011（4）：99-100.

［9］木拉提·克扎衣别克，阿不都热依木·玉苏甫，哈木拉提·吾甫尔.异常黑胆质成熟剂总黄酮和总酚的含量测定［J］.时珍国医国药，2009，20 （3）：519-522.

［10］李文仙，俞丹，林玲，等.Fo1in-Cioca1teu比色法应用于蔬菜和水果总多酚含量测定的研究［J］.营养学报，2011，33（3）：302-307.

［11］郭树琴，吴胜举，李岱.响应面法优化超声提取绿茶茶多酚工艺［J］.生物加工过程，2009，7（1）：39-43.

［12］李金凤，段玉清，马海乐，等.板栗壳中多酚的提取及体外抗氧化性研究［J］.林产化学与工业，2010，30（1）：53-58.

［13］涂佳，邓学良，李忠海，等.响应面法优化野生毛葡萄中原花青素醇提工艺的试验［J］.湖南林业科技，2010，37（1）：1-6.

［14］陈宇，邓金木，林丽丽，等.竹叶总黄酮提取工艺研究［J］.莆田学院学报，2012，19（2）：38-41.

［15］丁双华，叶立斌，陈卫，等.响应面优化提取桑叶多酚的研究［J］.中国食品学报，2012，12（1）：52-58.

Optimization of po1ypheno1s extraction techno1ogy fromPyracantha fortuneanafruit by response surface methodo1ogy

WU Wei1，2，LI Ge2，XIANG Fu1，3* （1.Hubei Co11aborative Innovation Center for the Characteristic Resources Exp1oitation of Dabie Mountains，Huangzhou 438000，China；2.Medica1 Co11ege，Hubei Po1ytechnic University，Huangshi 435003，China；3.Co11ege of Life Sciences，Huanggang Norma1 University，Huangzhou 438000，China）

UsingPyracantha fortuneanaas raw materia1，po1ypheno1 was extracted using ethano1 as extraction so1vent.On the basis of sing1e factor experiment，the optima1 extraction condition was determined by three factors and three 1eve1s Box-Behnken experiment as fo11ows:ethano1 concentration 70%，extraction temperature 70℃，time 4 h，so1id-1iquid ratio 1∶20（g∶m1），and extraction times 3.Under this conditions，the verification resu1ts showed that the po1ypheno1s extraction rate was 2.84%，which was approached to the theoretica1 va1ue 2.85%.

Pyracantha fortuneanafruit；po1ypheno1s；extraction；response surface methodo1ogy

R284.2

A

0254-5071（2015）12-0127-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.12.028

2015-10-11

大别山特色资源开发湖北省协同创新中心创新团队项目（2015TD07）

吴伟（1979-），男，副教授，博士，研究方向为生物技术制药。

向福（1977-），男，副教授，博士，研究方向为天然植物资源利用。