超声弹性成像定量指标和半定量评分与乳腺肿瘤成纤维细胞分布的关联性分析

刘　焱，郭　君，齐长海，郭婧慧，程　昀，梁　蕾

(1. 辽宁医学院航天中心医院研究生培养基地超声科，北京 100049；2. 辽宁医学院航天中心医院研究生培养基地病理科，北京 100049)

超声弹性成像定量指标和半定量评分与乳腺肿瘤成纤维细胞分布的关联性分析

刘焱1，郭君1，齐长海2，郭婧慧1，程昀1，梁蕾1

(1. 辽宁医学院航天中心医院研究生培养基地超声科，北京 100049；2. 辽宁医学院航天中心医院研究生培养基地病理科，北京 100049)

目的:探讨乳腺占位性病变超声弹性成像定量指标和半定量评分与成纤维细胞分布的关联性，阐明超声弹性成像定量指标和半定量评分在乳腺肿瘤诊断中的价值。方法:对38例乳腺占位性病变进行超声弹性成像检查，并对弹性图像进行定量分析，获得11个特征量及相应的弹性应变率比值，进行半定量评分，根据病理结果将其分为良性组和恶性组,采用免疫组织化学法分别检测乳腺间质穿膜糖蛋白(CD34)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达,分析成纤维细胞在乳腺病变中的分布特征,研究乳腺弹性成像定量评价指标和半定量评分与成纤维细胞分布的关联性。结果:恶性组乳腺组织中CD34表达水平明显低于良性组，而恶性组α-SMA表达水平明显高于良性组，CD34和α-SMA在良性和恶性乳腺占位病变中表达水平比较差异有统计学意义(P<0.01)。 恶性组弹性成像以蓝色为主，良性组弹性成像以绿色为主，2组间弹性成像评分比较差异有统计学意义。CD34在乳腺肿瘤组织中的表达与弹性成像评分呈负相关关系(r=-0.423 7，P=0.027 3)，α-SMA在乳腺肿瘤组织中的表达与弹性成像评分呈正相关性关系(r=0.397 0，P=0.014 2)。CD34与11个特征量中应变均值及均等性、蓝色区域百分比、峰度、偏度、杂乱度均有相关性(P<0.05)，其中与应变均值(r=0.385 6，P=0.016 8)及均等性(r=0.380 5，P=0.018 5)呈正相关关系，与蓝色区域百分比(r=-0.351 7，P=0.030 4)、峰度(r=-0.427 7，P=0.007 4)、偏度(r=-0.394 6，P=0.014 2)、杂乱度(r=-0.344 3，P=0.034 3)、一致性(r=-0.484 9，P=0.002 0)及弹性应变率比值(r=-0.379 0，P=0.047 5)呈负相关关系，与标准偏差、复杂度、相关性和对比度无相关性(P>0.05)；而α-SMA与峰度(r=0.356 9，P=0.027 8)和偏度(r=0.323 0，P=0.047 9)、蓝色区域百分比(r=0.382 0，P=0.021 6)以及弹性应变率比值(r=0.403 3，P=0.012 0)有相关性，并呈正相关关系。结论：超声弹性成像定量指标和半定量评分与成纤维细胞在乳腺肿瘤中的分布具有相关性，有助于在术前通过无创手段初步判断患者预后，可为乳腺癌的术前诊断、治疗和手术时机选择提供重要参考依据。

乳腺肿瘤；成纤维细胞；超声弹性成像；组织弥散定量分析

2014年超声弹性成像技术已被纳入美国国立综合癌症网络(NCCN)乳腺癌指南，其通过乳腺肿瘤的弹性差异反映病变的硬度差异从而鉴别乳腺肿瘤的良恶性。成纤维细胞是乳腺间质的主要成分，乳腺癌间质肌成纤维细胞(myofibroblasts，MFS)增生程度决定肿瘤的硬度和上皮细胞的恶性行为。因此，MFS 与超声弹性成像指标密切相关[1]。目前超声弹性成像组织弥散定量分析技术多应用在评估慢性肝病严重程度方面，而在乳腺肿瘤方面的研究仅为半定量分析[2]。在乳腺肿瘤超声弹性成像获得组织弥散分析定量参数和半定量评价指标与MFS相关的分子病理学指标分析国内外尚无报道。本研究旨在初步分析乳腺肿瘤超声弹性成像获得的组织弥散分析定量参数和半定量评价指标与MFS相关的分子病理学指标——α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA) 及穿膜糖蛋白(CD34)之间的关联性，探讨11个特征量分布特征的关联性，为乳腺癌的早期诊断及个体化靶向治疗提供依据。

1　资料与方法

1.1研究对象收集2013年3月—2014年10月于本院就诊的女性患者共38例，年龄21～76岁，平均(45.9±16.9)岁，所有病例均行超声弹性成像检查并获得相应的定量参数指标。病灶最大径为0.5～2.8 cm，平均(1.8±1.3)cm，为避免病灶过大而影响超声弹性成像参数的准确性，病灶最大径均小于3.0 cm。恶性肿瘤22例(恶性组)，其中浸润性导管癌20例，原位癌1例，髓样癌1例；非恶性肿瘤16例(良性组)，纤维腺瘤7例，腺病7例，导管内乳头状瘤1例，炎性病变1例。所有病灶均进行超声引导下穿刺活检或手术获得病理结果。

1.2仪器与方法使用日本Hitachi公司HiVision 900彩色多普勒超声诊断仪，探头L-74 M，频率5～13 MHz，仪器自带弹性组织弥散定量分析软件。首先行常规乳腺超声检查，观察病灶位置、数目、大小、形态、内部回声和血流情况等。根据病灶位置调整患者体位，尽可能使病灶保持水平位置，切换至弹性成像模式，弹性成像范围包括病灶及其周围组织，总面积约为病灶的3～4倍，应用实时显示功能观察灰阶超声图与弹性图，采用手动平稳微小抖动施压，至获得稳定、可重复的动态弹性图，以1～5的数值实时显示施压程度，当压力指示值为4时，方可评估检查结果并认定其结果有效[2-3]，对病灶进行弹性评分后，通过软件分析获得组织弥散定量分析特征量，图像存入超声诊断仪，经2名经验丰富的超声科医师分别对病灶图像进行分析。乳腺弹性评分方法采用罗葆明改良评分标准[4]，根据弹性图像中不同色彩的分布特征：1分，病灶整体或大部分显示为绿色；2分，病灶显示为中心呈蓝色，周边为绿色；3分，病灶范围内显示为绿色和蓝色所占比例相近；4分，病灶整体为蓝色或内部伴有少许绿色；5分，病灶及周边组织均显示为蓝色，内部伴有或不伴有绿色。

1.3组织弥散定量参数的测量应用弹性组织弥散定量分析软件对图像进行分析，首先根据病灶的形状采用椭圆形或多点描计的方法，尽可能包络整个病灶，以获得病灶区硬度与周围同深度组织之间的弹性应变率(strain ratio)比值。然后选取不超出病灶范围的最大矩形面积，测量3次,取平均值，得到病灶的11个组织弥散定量参数，包括应变均值(MEAN)、标准差(SD)、蓝色区域面积(AREA%)、复杂度(COMP)、峰度(KURT)、偏度(SKEW)、对比度(CONT)、均等性(ENT)、杂乱度(IDM)、一致性(ASM)和相关性(CORR)。

1.4免疫组织化学法采用免疫组织化学Elivision法：CD34(克隆号QBEnd/10)、α-SMA(克隆号1A4)，抗体均为单克隆抗体，所用试剂购自福州迈新生物技术开发有限公司。用已知阳性切片做阳性对照，用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗做阴性对照。阳性结果判定： CD34,以细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性判定标准;α-SMA,细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性判定标准。阳性细胞分析：CD34和α-SMA结果判定采用双评分半定量法进行评分。①显色度按切片中细胞显色有无及深浅记分:细胞无显色记为0分，浅棕黄色记为1分，棕黄色记为2分，棕褐色记为3分。② 光镜下每张切片选取10个高倍(×400)视野，每个视野计数100个细胞，按阳性细胞所占百分比分为4个等级:阳性细胞<10%记为0分，10%～25%记为1分,26%～50%记为2分，>50%记为3分。将①+②得分相加，得0～1分为阴性表达(-)，2～3分为低度表达(+)，4～5分为中度表达()，6分为强度表达()。

1.5统计学分析采用SPSS 12.0统计软件进行分析。采用正态性检验分析乳腺良、恶性病变弹性成像11个特征量是否符合正态性分布，正态分布数据采用t检验，非正态分布数据采用非参数U检验。乳腺良、恶性病变弹性评分的比较以及 CD34和α-SMA在乳腺良、恶性肿瘤组织中表达水平比较采用Willcox秩和检验；11个弹性特征量参数与 CD34和α-SMA的相关性采用Spearman相关性分析。检验水准α=0.05。

2　结　果

2.1超声弹性评分恶性组超声弹性成像以蓝色为主，良性组超声弹性成像以绿色为主，2组间弹性成像评分比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1乳腺良和恶性病变弹性评分

Tab.1Quantitative scores from ultrasound elastography of benign and malignant breast tumor

GroupQuantitativescore12345TotalBenign10420016Malignant02351222Total116551238

2.2CD34和α-SMA的定位及表达情况CD34在间质成纤维细胞中的表达：良性组中CD34蛋白主要定位于细胞质中， 13例良性病灶有不同程度的阳性表达，占81.8%(13/16)；乳腺导管原位癌导管周围间质成纤维细胞数量明显减少，偶见表达；所有浸润性导管癌的间质中均缺乏CD34表达，周围无癌细胞浸润的正常区域可见CD34表达、其中3例为中度表达，占13.6%(3/22)。α-SMA在间质成纤维细胞中的表达：α-SMA蛋白在良性病灶成纤维细胞间质中不表达，主要定位于导管肌的上皮细胞中，而在恶性病灶的细胞间质中呈强阳性表达，导管肌上皮细胞表达缺失。7例纤维腺瘤间质成纤维细胞中α-SMA阴性表达6例，1例有轻度表达(+)，7例腺病中2例成纤维细胞α-SMA有轻度表达(+)，余良性病变为阴性表达；18例浸润性导管癌间质中成纤维细胞有不同程度的α-SMA表达，阳性率为90%(18/20)，1例髓样癌间质中成纤维细胞α-SMA为中度表达()，1例原位癌为阴性表达。CD34和α-SMA在乳腺良和恶性病灶中的表达比较差异有统计学意义(P=0.000)。见表2和图1～4(封三)。

表2　CD34和α-SMA在乳腺良、恶性肿瘤组织中的表达

2.3CD34和α-SMA表达与弹性成像评分相关性分析CD34表达和弹性成像评分呈负相关关系(r=-0.423 7，P=0.027 3)，α-SMA表达和弹性成像评分呈正相关关系(r=0.397 0，P=0.014 2)。

2.4CD34和α-SMA与乳腺肿瘤弹性成像组织弥散定量参数的关联性分析 免疫组织化学指标CD34与11个特征量中应变均值及均等性、蓝色区域百分比、峰度、偏度和杂乱度均有相关性(P<0.05)，其中与应变均值及均等性呈正相关关系，与蓝色区域百分比、峰度、偏度、杂乱度和一致性呈负相关关系；与标准偏差、复杂度、相关性、对比度无相关性(P>0.05)，与弹性率比值呈负相关关系(r=-0.379 0，P=0.047 5)。 α-SMA与峰度(r=0.356 9，P=0.027 8)、偏度(r=0.323 0，P=0.047 9)、蓝色区域百分比(r=0.382 0，P=0.021 6)及弹性应变率比值(r=0.403 3，P=0.012 0)均有相关性，与其他特征量均无相关性(P>0.05)。见表3。

3　讨　论

过去对于乳腺肿瘤的研究主要集中在肿瘤的实质细胞，认为肿瘤是上皮基因和表型改变而导致的增殖结果[5]。近年来人们逐渐认识到肿瘤的生长、侵袭和转移并不是肿瘤细胞独立完成的，其中有趋化因子网络体系对肿瘤细胞的协同作用[6]。在乳腺肿瘤的发生、发展过程中，肿瘤间质营造了利于肿瘤细胞生长的微环境。肌成纤维细胞，也称MFS，是肿瘤间质的主要成分，MFS 的出现有助于对早期恶性病变做出诊断，也有助于良、恶性疾病的鉴

表3CD34与乳腺肿瘤弹性成像组织弥散定量参数的相关性

Tab.3Correlation between CD34 and characteristics from ultrasound elastography of breast tumor

CharacteristicCorrelationcoefficientPvalueMean0.38560.0168Standarddiviation0.10850.5167Arearatiooflow-strainregion-0.35170.0304Complexity0.01550.9266Kurtosis-0.42770.0074Skewness-0.39460.0142Contrast0.11010.5107Entropy0.38050.0185Inversedifferencemoment-0.34430.0343Angularsecondmoment-0.48490.0020Correlation-0.06070.7172

别诊断。本研究结果显示：在良性病变中CD34蛋白不同程度地表达于MFS细胞质中，α-SMA蛋白主要定位于导管肌的上皮中；在恶性肿瘤中CD34蛋白主要定位于血管中，α-SMA主要定位于细胞质中。乳腺癌间质细胞中，CD34表达缺失，而α-SMA为大量表达；良性病变间质细胞中α-SMA表达缺失或轻度表达，而CD34有不同程度的表达。由此可见，通过CD34和α-SMA的表达情况可以判断肿瘤中是否存在，从而判断其在肿瘤中的分布特征，与徐继等[7]对乳腺纤维间质成纤维细胞中α-SMA表达的研究结果相一致。在癌组织中MFS分布于肿瘤侵袭前沿、肿瘤-间质界面或肿瘤间质中靠近肿瘤血管内皮细胞并包绕着癌巢[1]。MFS对乳腺癌干细胞的表达具有正向调控作用，其增生程度又决定肿瘤的硬度。1991年Ophir等[8]提出弹性成像技术，随后逐渐发展为一种实时成像的超声技术，根据不同组织间弹性系数的差异，在受到外力压迫后组织发生形变的程度不同而表现为相应的色彩来表示组织的硬度，目前在乳腺中的应用最为成熟，形成弹性成像中弹性差异的主要原因是肿瘤的硬度差异[9]。本组研究结果显示：CD34的表达与弹性成像评分呈现负相关关系，α-SMA表达与弹性成像评分呈正相关关系。与郝轶等[1]报道结果一致。由此可见，在乳腺肿瘤中超声弹性成像的评分越高，则表示α-SMA蛋白在乳腺肿瘤中表达越强，即超声弹性成像的评分越高，则表示MFS在肿瘤中表达越强。因此，超声弹性成像评分可以对MFS的分布情况进行初步判断。

Hitachi公司开发的组织弥散定量分析软件的核心为实时组织弹性成像的特征量提取和与组织弥散程度分级的组织分析[10]，通过对应变直方图测算获得的11个弹性图像的特征量数据用多元回归方程算出定量值，应用于组织弹性的定量研究，有学者[11]将此应用于评估慢性肝病严重程度的临床应用研究，并发现其对无创区分慢性肝病各阶段方面有较好的临床价值。本研究将组织弥散定量分析软件应用于乳腺肿瘤的测定，结果表明：11个特征量中应变均值及均等性、蓝色区域百分比、峰度、偏度、杂乱度与免疫组织化学指标CD34均有相关性，其中与应变均值及均等性呈正相关关系，与蓝色区域百分比、峰度、偏度、杂乱度、一致性和弹性率比值呈负相关关系，与标准偏差、复杂度、相关性、对比度无相关性；而α-SMA与特征量中的峰度、偏度、蓝色区域百分比以及弹性应变率比值均有相关性，并呈正相关关系。与CD34和α-SMA共同具有相关性的特征量是峰度、偏度、蓝色区域百分比、弹性率比值，并且相关性相反。弹性区域色彩应变率主要反应指标中的蓝色区域百分比、弹性直方图主要反应指标峰度和偏度以及弹性应变率比值越大，提示病变的硬度越高，CD34在乳腺肿瘤中表达越弱，α-SMA蛋白表达越强，MFS在乳腺肿瘤中表达越明显[12-13]；而11个特征量中反应病灶均匀一致性的定量指标均等性、杂乱度、相关性、一致性与α-SMA无相关性。本研究结果提示：组织弥散定量分析软件能够从弹性成像定量的角度初步提示CD34和α-SMA的表达情况，峰度、偏度、蓝色区域百分比以及弹性率比值作为敏感指标可提示MFS的分布情况，从而间接反映肿瘤良、恶性。

综上所述，超声弹性成像定量指标和半定量评分与乳腺肿瘤中成纤维细胞的分布具有相关性，鉴于间质成纤维细胞的生物学特性可反映病变性质及利于乳腺癌的鉴别诊断和病情判断，超声弹性成像定量参数和半定量评分以及分子病理学指标可为乳腺肿瘤提供更多有价值的鉴别诊断信息，有助于在术前通过无创手段初步判断患者预后，为乳腺癌的术前诊断、治疗及手术时机的选择提供重要参考依据。但本研究的样本量较小，有待进一步扩充样本量深入研究。

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Analysis on correlation between quantitative results and semi-quantitative scores from ultrasound elastography and distribution of myofibroblasts in breast tumor

LIU Yan1,GUO Jun1,QI Changhai2,GUO Jinghui1,CHENG Yun1,LIANG Lei1

(1. Department of Ultrasound, Graduate Training Basement,Aerospace Central Hospital, Liaoning Medical University，Beijing 100049，China;2. Department of Pathology, Graduate Training Basement, Aerospace Central Hospital, Liaoning Medical University，Beijing 100049，China)

ObjectiveTo investigate the correlation between the quantitative results, the semi-quantitative scores from ultrasound elastography and the distribution of myofibroblasts(MFS) in breast tumor,and to analyze the value of quantitative results and the semi-quantitative score from ultrasound elastography in the diagnosis of breast tumor.MethodsThirty eight patients with breast lesions underwent ultrasound elasticity examinations, tissue dispersion quantitative analysis technique was used to assess the 11 characteristic quantities and the corresponding strain ratios in all lesions,and the score of ultrasonic elastography was evaluated.38 cases were divided into benign and malignant group according to pathological diagnosis results.The expression levels of CD34 and α-SMA protein in breast tissue were examined by immunohistochemistry.The distribution patterns of MFS in breast tumor were analyzed.The correlation between the quantitative results, the semi-quantitative scores from ultrasound elastography and the distribution of MFS in breast tumor was studied．ResultsThe expression level of CD34 in malignant group was significantly higher than that in benign group，while the expression level of α-SMA was significantly higher than that in benign group;the differences in the expression levels of CD34 and α-SMA between benign and malignant breast tumor patients were statistically significant(P<0.01). The masses observed in malignant group by elastography were shown in blue，while most of the masses in benign group were shown in green.There were statistically significant differences between two groups in elastography scores(P<0.05).There was a anegative correlation between the CD34 expression in tumor tissue and the score of ultrasound elastography (r=-0.423 7，P=0.027 3).There was a negative correlation between the CD34 expression and the score of ultrasound elastography(r=-0.423 7，P=0.027 3)，while the positive correlation was found between the α-SMA expression and the score of ultrasound elastography(r=0.397 0，P=0.014 2).The CD34 expression was significantly correlated with the average relative strain value, entropy, area ratio of low-strain region, kurtosis, skewness and inverse difference moment (P<0.05).Among the 11 characteristics, CD34 was positively correlated with the average relative strain value(r=0.385 6，P=0.016 8) and entropy(r=0.380 5，P=0.018 5);CD34 was negatively correlated with area ratio of low-strain region(r=-0.351 7，P=0.030 4), kurtosis(r=-0.427 7，P=0.007 4), skewness(r=-0.394 6，P=0.014 2),inverse difference moment(r=-0.344 3，P=0.034 3), angular second moment(r=-0.484 9，P=0.002 0) and strain ration(r=-0.379 0，P=0.047 5);CD34 was not correlated with standard deviation, complexity and contrast(P>0.05). The α-SMA espression was positively correlated with kurtosis(r=0.356 9，P=0.027 8), skewness(r=0.323 0，P=0.047 9), area ratio of low-strain region(r=0.382 0，P=0.021 6)and strain ratio(r=0.403 3，P=0.012 0).ConclusionThe features and its scores of ultrasound elastography are correlated with the distribution of MFS in breast tumor, suggesting that the ultrasound elastography is very informative and helpful in the diagnosis of breast tumor.

breast neoplasms;fibroblasts;ultrasound elastography imaging; tissue dispersion quantitative analysis

1671-587Ⅹ(2015)06-1288-05

10.13481/j.1671-587x.20150637

2015-03-09

辽宁医学院航天中心医院院内项目资助课题(YN201406)

刘焱(1972-)， 女，吉林省长春市人，副主任医师 ，在读医学硕士，主要从事乳腺肿瘤的诊断及介入超声方面的研究。

郭君，主任医师，硕士研究生导师(Tel:0431-59971519,E-mail:guojun0316@sohu.com)

R737.9

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