氟尿嘧啶联合顺铂对骨肉瘤MG-63细胞的抑制作用及其对TRPV5和TRPV6蛋白表达的影响

那　键，戴维享，马　超，张晓东，邵长青，刘　勇，王秀力，刘　颖

(1.江苏省徐州市中心医院骨科， 江苏 徐州 221009;2.江苏省徐州市心血管病研究所，江苏 徐州 221009)

氟尿嘧啶联合顺铂对骨肉瘤MG-63细胞的抑制作用及其对TRPV5和TRPV6蛋白表达的影响

那键1，戴维享1，马超1，张晓东1，邵长青1，刘勇1，王秀力2，刘颖2

(1.江苏省徐州市中心医院骨科， 江苏 徐州 221009;2.江苏省徐州市心血管病研究所，江苏 徐州 221009)

目的:研究氟尿嘧啶联合顺铂对骨肉瘤细胞株MG-63的生长抑制作用，探讨其对瞬时性受体电位通道5(TRPV5)和瞬时性受体电位通道6(TRPV6)蛋白表达的影响。 方法:常规培养MG-63细胞，以5×104mL-1的细胞密度种植细胞，实验分为对照组、氟尿嘧啶组、顺铂组及氟尿嘧啶联合顺铂组4组。CCK-8法检测不同时间MG-63细胞的生长抑制情况；分别于24、48和72 h采用细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒检测MG-63细胞加入不同药物后的凋亡情况；免疫细胞化学染色法检测MG-63细胞在加药前后TRPV5和TRPV6蛋白的表达情况。结果:氟尿嘧啶和顺铂对MG-63细胞的抑制作用均显著，且随着药物浓度的增加和作用时间的延长，细胞中黑色颗粒增多，胞体回缩，细胞老化或死亡。与两药单独或是联用作用于MG-63细胞24 h比较，随着时间的延长，48 h 和72 h两者对细胞的抑制作用明显增强(P<0.05)。与对照组比较，氟尿嘧啶组和顺铂组24、48和72 h后凋亡率逐渐增加(P<0.01)，随着药物作用时间的延长，细胞凋亡率亦呈升高的趋势。当加入氟尿嘧啶和顺铂72 h后，MG-63细胞表达TRPV5和TRPV6含量较加药前明显降低(P<0.05)。结论:氟尿嘧啶与顺铂联用可以提高MG-63细胞增殖抑制及凋亡作用，同时对MG-63细胞TRPV5和TRPV6表达水平具有明显的抑制作用。

氟尿嘧啶；顺铂；骨肉瘤；骨肉瘤细胞株MG-63；瞬时性受体电位通道

肿瘤细胞的主要特征是细胞增殖不受控制且减少了细胞的凋亡，而细胞凋亡的降低可以导致肿瘤细胞对化疗的耐药，从而阻碍对恶性肿瘤的治疗，这其中就包括骨肉瘤[1-3]。骨肉瘤是发生于未成年人的最常见的恶性骨肿瘤，约60%的恶性骨肿瘤发生在20岁之前[4-5]。目前对骨肉瘤的治疗主要是手术并辅以化学治疗，还有一些其他的综合治疗，但是对一些化学治疗的抗药性仍然会阻碍骨肉瘤的治疗。单一化疗药物往往难以达到治疗效果，因此人们都在探索一种既安全又有效的治疗方法[6]，这其中就包括将几种化疗药物联合应用于骨肉瘤的治疗之中。瞬时性受体电位通道5(transient receptor potential vanilloid 5 TRPV5)和瞬时性受体电位通道6(transient receptor potential vanilloid 6,TRPV6)是瞬时性受体电位通道(transient receptor potential，TRP)超家族中的成员，是专门的上皮样钙离子通道蛋白，与钙离子跨细胞膜转运有关。现已知钙离子与细胞分化、增殖和程序性死亡有关。为了了解氟尿嘧啶与顺铂(ccis-dichlorodia mineplatinum,DDP)联合用药对骨肉瘤细胞生长的影响，本研究将氟尿嘧啶联合顺铂作用于骨肉瘤细胞株MG-63，观察其对MG-63细胞生长和TRPV5、TRPV6蛋白表达的影响，为氟尿嘧啶联合顺铂应用于临床治疗骨肉瘤奠定一定的理论基础。

1　材料与方法

1.1细胞、主要试剂和仪器人骨肉瘤MG-63细胞株来自中国科学院上海生科院细胞资源中心，用含10%胎牛血清(Hyclone公司,美国)、100 U·mL-1青霉素、100 mg·L-1链霉素双抗合剂(Invitrogen公司，美国)的DMEM/高糖(Gibco公司，美国)培养基，于37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养。顺铂(江苏豪森药业股份公司)；氟尿嘧啶(天津金耀氨基酸有限公司)；Cell Counting Kit(CCK-8)试剂盒和细胞凋亡-Hoechst试剂盒(海门市碧云天生物科技有限公司)；TRPV5和TRPV6单克隆抗体(Sigma公司，美国)。倒置相差显微镜和正置显微镜(Olympus公司，日本)，酶标仪(TECAN公司,瑞士)，CO2细胞培养箱(Thermo公司，美国)。

1.2CCK-8法测定各组MG-63细胞生长抑制率实验分对照组、氟尿嘧啶组、顺铂组和氟尿嘧啶联合顺铂组4组。制备MG-63细胞悬液，以5×104mL-1细胞浓度接种于96孔培养板中，每孔100 μL，每组设5个平行孔，细胞贴壁培养过夜后取出培养板，各组分别加入不同浓度的药物各1 μL，其中氟尿嘧啶组氟尿嘧啶终浓度分别为5、10、20、50、100和200 mg·L-1；顺铂组顺铂终浓度分别为0.125、0.250、0.500、1.000、2.000和5.000 mg·L-1);对照组不加任何药物。分别于24、48和72 h后取出细胞进行CCK-8检测，操作方法严格按照CCK-8检测试剂盒说明书进行。上述实验均重复3次，取平均值，按以下公式计算抑制率。细胞生长抑制率(%)=(1-实验组的A450值/对照组A450值)×100。

1.3Hoechst染色法检测各组MG-63细胞凋亡率采用Hoechst染色试剂盒，氟尿嘧啶组终浓度分别为5、10、20、50、100和200 mg·L-1；顺铂组终浓度分别为0.125、0.250、0.500、1.000、2.000和5.000 mg·L-1，二者联合用药的组合编号分别是：1、2、3、4、5和6。细胞培养方法同1.1，细胞接种于35 mm培养皿中，细胞浓度为5×104mL-1，分别于培养24、48和72 h进行检测，染色方法严格按照说明书进行，在荧光显微镜下检测呈蓝色的细胞核。激发波长约350 nm，发射波长约460 nm。

1.4免疫细胞化学染色法检测MG-63细胞在加药前后TRPV5和TRPV6蛋白表达 按5×104mL-1的细胞密度接种细胞于35 mm培养皿中，72 h后对细胞行免疫细胞化学染色，具体方法见参考文献[7]。一抗为抗TRPV5和抗TRPV6单克隆抗体，对照染色以PBS代替一抗。采用Imagepro Plus 6.0分析软件处理免疫组织化学图片，分析其A值，以此来检测蛋白表达水平。

2　结　果

2.1细胞形态学改变 氟尿嘧啶组、顺铂组和氟尿嘧啶联合顺铂用药组24、48和72 h时细胞中黑色颗粒增多，胞体回缩，细胞密度减小，细胞状态变差，且随着药物作用时间的延长及药物浓度的增加细胞形态越来越不规则，细胞老化或死亡。100 mg·L-1氟尿嘧啶、2.0 mg·L-1顺铂及二者联合用药后MG-63细胞形态学及生长状态的变化情况。见图1。

图1　各组不同时间MG-63细胞形态(×200)

2.2CCK-8法检测不同浓度氟尿嘧啶作用不同时间MG-63细胞生长抑制率与5 mg·L-1氟尿嘧啶组比较，10、20、50、100和200 mg·L-1氟尿嘧啶组MG-63细胞的生长抑制率增加(P<0.05)；与24 h比较，随着时间的延长，48和72 h时细胞生长抑制率明显升高(P<0.05)。见表1。

2.3CCK-8法检测不同浓度顺铂作用不同时间MG-63细胞生长抑制率与0.125 mg·L-1顺铂组比较，0.250、0.500、1.000、2.000和5.000 mg·L-1DDP组MG-63细胞生长抑制率逐渐升高(P<0.05)；与24 h比较，随着时间的延长，48和72 h细胞的生长抑制率明显升高(P<0.05)。见表2。

2.4CCK-8法检测不同浓度氟尿嘧啶联合顺铂作用不同时间MG-63细胞生长抑制率与5 mg·L-1氟尿嘧啶联合0.125 mg·L-1DDP组比较，其他各浓度组MG-63细胞生长抑制率逐渐升高(P<0.05)，与24 h比较，随着时间的延长，48 h 和72 h时细胞的生长抑制率明显升高(P<0.05)。见表3。

表1不同浓度氟尿嘧啶作用不同时间MG-63细胞生长抑制率

*P<0.05 compared with 5 mg·L-1fluorouracil group;△P<0.05 compared with 24 h .

表2不同浓度顺铂作用不同时间MG-63细胞生长抑制率

*P<0.05 compared with 0.125 mg·L-1DDP group;△P<0.05 compared with 24 h.

表3不同浓度氟尿嘧啶联合顺铂作用不同时间MG-63细胞生长抑制率

*P<0.05 compared with 1 group;△P<0.05 compared with 24 h.

2.5Hoechst染色法检测MG-63细胞凋亡细胞凋亡早期，细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，细胞质密度增加，核质浓缩。见图2(插页四)。 与对照组比较，各组MG-63细胞凋亡率逐渐升高(P<0.01)，与24 h比较，随着时间的延长，48和72 h时细胞凋亡率明显升高(P<0.01)。见表4。

表4各组MG-63细胞凋亡率

GroupApoptoticrate(t/h) 244872Control1.17±0.033.21±0.886.08±1.27Fluorouracil3.58±0.27*6.78±0.54*△13.21±2.13*△DDP6.12±0.42*11.41±0.32*△20.74±0.98*△Fluorouracil+ DDP11.29±0.64*25.14±1.14*△45.15±2.45*△

*P<0.01 compared with control group;△P<0.01 compared with 24 h.

2.6MG-63细胞在加药前后TRPV5和TRPV6蛋白表达水平MG-63细胞在加药之前TRPV5和TRPV6蛋白表达明显，当加入氟尿嘧啶和顺铂72 h时，TRPV5和TRPV6蛋白表达水平明显降低，与加药前比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图3(插页四)和表5。

表5加入氟尿嘧啶和顺铂前后MG-63细胞TRPV5和TRPV6蛋白表达水平

*P<0.05 compared with before treatment.

3　讨　论

生长区域的骨最容易发生骨肉瘤，越来越多的证据[8-11]表明：骨肉瘤从本质上讲是一种分化疾病，即来源于骨髓间充质干细胞的成骨细胞分化发生了遗传和表观遗传变异，从而转化成了骨肉瘤，呈现出一种高的转移潜能。尽管外科手术移除了原发骨肉瘤，并相继进行几个周期的放疗和化疗，但是由于其侵袭性和远端转移，患者往往伴有不良的预后,患者的存活率不到20%。虽然骨肉瘤患者对某些化疗药物耐药，但是目前来说当患者进行手术治疗后就需要行化疗作为辅助治疗。

氟尿嘧啶为嘧啶类的氟化物，属于抗代谢抗肿瘤药，能抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，阻断脱氧嘧啶核苷酸转换成胸腺嘧啶核苷核，干扰DNA合成。对RNA的合成也有一定的抑制作用。临床用于结肠癌、直肠癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、绒毛膜上皮癌、恶性葡萄胎、头颈部鳞癌、皮肤癌、肝癌和膀胱癌等。DDP属细胞周期非特异性药物，具有细胞毒性，可抑制癌细胞的DNA复制过程，并损伤其细胞膜上结构，有较强的广谱抗癌作用。临床对于卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、肺癌、鼻咽癌、食道癌、恶性淋巴瘤、头颈部鳞癌、甲状腺癌及成骨肉瘤等多种实体肿瘤的治疗均能显示疗效。

近期有文献[12-13]报道：氟尿嘧啶联合DDP用于肺癌、鼻咽癌及胃癌的治疗效果明显，但是还尚无用于骨肉瘤治疗的报道。所以本实验采用氟尿嘧啶与顺铂联合用药于骨肉瘤细胞株MG-63，观察二者联合用药对细胞增殖及凋亡影响。本研究结果显示：MG-63细胞加入不同药物作用24、48和72 h后，细胞密度减小，细胞状态变差，而且随着药物作用时间的延长及药物浓度的增加细胞形态越来越不规则，细胞生长状态越来越差。氟尿嘧啶和顺铂对MG-63细胞的抑制作用显著，且随着药物浓度的增加和作用时间的延长，抑制作用逐渐增强。二者联合对MG-63细胞的抑制作用更强，二者具有叠加作用，随着时间的延长，两者对细胞的抑制作用呈增强趋势。细胞凋亡早期，细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，细胞质密度增加，核质浓缩，氟尿嘧啶和顺铂单独用药24、48和72 h后，随着作用时间的延长，凋亡率逐渐增加，72 h时联合用药组细胞凋亡率达到(45.15±2.45)%。

上皮性钙通道成员钙离子通道TRPV5/TRPV6表现为对钙离子具有高度选择性,对钙离子代谢及骨代谢有着非常重要的作用[14]。最近的研究[15]表明：细胞的生存是受钙离子浓度调控的，如细胞的增殖和凋亡，而在肿瘤的发生和发展过程中，一些钙离子调节的信号通路也是参与其中的，TRPV5TRPV6作为肿瘤的标志物对于肿瘤的发生和发展也是非常重要[4]。在非小细胞肺癌中TRPV5TRPV6就呈高表达[15]。因此，研究骨肉瘤细胞中TRPV5和TRPV6的表达情况及其影响因素将有深远意义。本实验通过免疫组织化学技术检测发现骨肉瘤中存在TRPV5和TRPV6表达，阳性染色部位主要定位于一些肿瘤细胞的胞浆内，当加入氟尿嘧啶和顺铂72 h后，TRPV5和TRPV6蛋白表达水平明显降低，证明了二者联合应用对骨肉瘤细胞具有一定的抑制作用。虽然TRPV5和TRPV6在骨肉瘤细胞中的少许表达，只能说明在骨肉瘤中也可能存在TRPV5及TRPV6通道，但可望在今后的研究中以更灵敏的实验技术来检测或者以更多的样本数来揭示其表达规律。

综上所述，氟尿嘧啶联合顺铂可以提高MG-63细胞增殖抑制及凋亡作用，同时对MG-63细胞TRPV5和TRPV6蛋白表达具有明显的抑制作用。本研究结果为今后氟尿嘧啶与顺铂联合应用于骨肉瘤的临床治疗提供了一定的实验依据。

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Inhibitory effect of fluorouracil combined with DDP on human osteosarcoma cell line MG-63 and its influence in expressions of TRPV5 and TRPV6 proteins

NA Jian1,DAI Weixiang1,MA Chao1,ZHANG Xiaodong1,SHAO Changqing1,LIU Yong1,WANG Xiuli2, LIU Ying2

(1. Department of Orthopedics,Xuzhou Central Hospital, Jiangsu Province, Xuzhou 221009, China;2. Xuzhou Cardiovascular Disease Institute, Jiangsu Province, Xuzhou 221009, China)

ObjectiveTo study the inhibitory effect of fluorouracil combined with DDP on the growth of human osteosarcoma cell line MG-63, and to explore its influence on the expressions of transient receptor potential vanilloid 5 (TRPV5) and transient receptor potential vanilloid 6 (TRPV6) proteins.MethodsThe MG-63 cells were cultured by the density of 5×104mL-1.Fluorouracil group, DDP group, fluorouracil+DDP group and control group containing 10% FBS were set up.The inhibitory rates of growth of MG-63 cells at different time were detected by CCK-8 assay.The apoptosis of MG-63 cells after treated with different drugs was determined by Hoechst staining Kit.The immunocytochemical staining was used to treatent to detect the expressions of TRPV5 and TRPV6 before and after treatment.Results Fluorouracil and DDP both inhibited the growth of MG-63 cells in a time- and dose- dependent manner.There were a lot of black particles in the MG-63 cells and the cells were smaller, aging or death when they were exposed to fluorouracil or DDP.Compared with 24 h group, the inhibitory rates of proliferation of MG-63 cells after treated with the sigle drug of fluorouracil or DDP for 48 and 72 h were increased significantly (P<0.05).Compared with control group,the apoptotic rates of MG-63 cells in fluorouracil group and DDP group 24,48,and 72 h after treatment were increased (P<0.01) in a time-dependent manner.The expression levels of TRPV5 and TRPV6 in MG-63 cells 72 h after treatment of fluorouracil and DDP were decreased significantly compared with before treatment(P<0.05).ConclusionFluorouracil, DDP and fluorouracil combined with DDP could significantly inhibit the proliferation of MG-63 cells, induce the apoptosis, and decrease the expression levels of TRPV5 and TRPV6.

fluorouracil; cisplatin; osteosarcoma;osteosarcoma cell line MG-63; transient receptor potential vanilloid

1671-587Ⅹ(2015)06-1201-06

10.13481/j.1671-587x.20150620

2015-05-15

江苏省卫生厅“六大人才高峰”项目资助课题(2014-WSW-065)；江苏省徐州市科技发展项目资助课题(XM13B052)； 江苏省徐州市科技发展项目资助课题(XM13B086)

那键(1976-)，男，辽宁省大连市人，副主任医师，医学博士，硕士研究生导师，主要从事骨病、人工关节和骨质疏松的基础与临床方面的研究。

王秀力, 助理研究员，硕士研究生导师(Tel:0516-83956610,E-mail：wxljsq@163.com)

R738.1

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