FTY720对实验性肝纤维化小鼠肝损伤的保护作用

张宸豪，李　瑶，陈　为，赵良中，李　妍

( 吉林医药学院检验学院病原生物学教研室，吉林 吉林 132013 )

FTY720对实验性肝纤维化小鼠肝损伤的保护作用

张宸豪，李瑶，陈为，赵良中，李妍

( 吉林医药学院检验学院病原生物学教研室，吉林 吉林 132013 )

目的：观察FTY720对刀豆蛋白A(Con A)所致肝纤维化小鼠的保护作用，探讨其可能的作用机制。方法：采用刀豆蛋白A(Con A)建立小鼠肝纤维化动物模型，取40只BALB/C小鼠随机分为空白对照组、模型组、FTY720低剂量(1 mg·kg-1)组和FTY720高剂量(4 mg·kg-1)组，每组10只。测定各组小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)活性和肝脏指数，观察肝脏组织学病理变化。结果：FTY720低剂量组和高剂量组ALT、AST 活性明显低于模型组(P<0.05 或P<0.01)。光学显微镜观察，模型组有炎性细胞浸润，肝细胞坏死。Masson 染色，模型组血管周围有明显纤维条束，肝小叶发生融合；与模型组比较，FTY720低剂量组和高剂量组损伤程度较轻，且随FTY720剂量增加肝组织损伤程度逐渐减轻。结论：FTY720对实验性肝纤维化小鼠的保护作用可能是通过降低ALT 和AST活性，进而减轻肝脏损伤程度而延缓纤维化进程。

FTY720；刀豆蛋白A；肝纤维化；肝损伤；动物模型

Jilin 132013，China )

肝病是我国发病率高且危害最为严重的疾病之一，而肝纤维化是慢性肝炎和慢性肝损伤的共同特征。肝纤维化的病因目前尚不清楚，免疫因素在其发病机制中占重要地位[1]，肝脏炎症损伤过于激烈时为防止肝细胞大面积坏死，可使用免疫抑制剂抑制自身免疫反应。FTY720是1995年由日本学者从中药冬虫夏草培养液中提取并分离出的一种鞘氨醇样抗生素——多球壳菌素(myriocin),经过结构修饰后得到的化合物命名为FTY720，商品名芬戈莫德(Fingolimod)[2-3]。2010年，FTY720被美国食品药品管理局(FDA)批准作为多发性硬化症(multiple sclerosis ，MS)的一线治疗药物。作为一种新型免疫抑制剂，FTY720作用机制独特。FTY720可显著减少外周血中活化T和B淋巴细胞，减少淋巴细胞向移植器官内浸润[4-5]，具有抗移植排斥的免疫抑制作用 ，且不良反应较少。因此FTY720有望成为新一代免疫抑制剂而广泛用于器官移植和自身免疫性疾病的潜在治疗。目前尚未见有关FTY720对肝纤维化作用的报道。本研究采用刀豆蛋白A(concanavalin A，Con A)建立小鼠肝纤维化模型，探讨FTY720对实验性肝纤维化小鼠的保护作用及其作用机制。

1　材料与方法

1.1实验动物、主要试剂和仪器BALB/C小鼠，雄性，体质量18～22 g，购自长春亿斯实验动物技术有限公司，动物合格证号：SCXK(吉)-2011-0004 号； Con A Ⅳ 购自美国Sigma公司，FTY720购自美国Caymen公司，丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)购自南京建成生物技术有限公司，Masson三色胶原染色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；3502G型自动酶标仪(北京普天公司产品)，DP27型显微镜数码成像系统(日本奥林巴斯公司产品)。

1.2动物分组和处理实验选用健康雄性BALB/C小鼠40只，适应性喂养7 d，称体质量后随机分为空白对照组、模型组、FTY720低剂量组和FTY720高剂量组，每组10只。模型组和FTY720低、高剂量组小鼠均以10 mg·kg-1Con A 尾静脉注射，每周1次，连续9周；FTY720低量组和高剂量组分别于实验前3 d隔日给予小鼠1和4 mg·kg-1FTY720；对照组和模型组小鼠以等体积PBS缓冲液灌胃，连续9周。各组动物于末次给药24 h后，眼球放血处死，37℃生理盐水灌流2次，4%多聚甲醛灌流1次，心脏灌流后收获肝脏组织外固定48 h后，行组织病理学检查。

1.3检测指标和方法小鼠处死前眼球采血，静置30 min后3 000 r·min-1离心10 min，分离血清按改良赖氏法测定ALT和AST活性。称取肝脏总质量，计算肝脏指数。

1.4肝组织病理学分析取心脏灌流后小鼠肝脏右叶组织标本，4%多聚甲醛固定48 h 后，常规石蜡包埋、切片。HE染色和Masson三色染色分析小鼠肝脏损伤及纤维化程度。

2　结　果

2.1各组小鼠血清生化指标和肝脏指数造模9周后，眼球取血，分离血清，测定ALT和AST活性，与空白对照组比较，模型组小鼠血清ALT和AST活性明显升高(P<0.01)；与模型组比较，FTY720低和高剂量组小鼠血清ALT和AST活性明显降低(P<0.01)，但高于空白对照组(P<0.01)。与空白对照组比较,模型组小鼠肝脏指数明显升高(P<0.01)；与模型组比较， FTY720低和高剂量组小鼠肝脏指数明显降低(P<0.05)。见表1。

2.2小鼠肝组织HE染色和Masson 染色HE结果:正常对照组小鼠肝脏组织肝细胞索清晰可见，呈放射状排列，细胞形态正常，无炎性细胞浸润；模型组小鼠肝脏组织肝细胞索排列紊乱，肝细胞肿大变形，呈气球样变，个别区域肝细胞坏死明显，有炎性细胞浸润。与模型组比较，FTY720低和高剂量组细胞肿胀减轻，肝细胞索可见，且有少许淋巴细胞浸润。见图1(插页三)。Masson 染色：空白对照组小鼠无纤维组织明显沉积，肝细胞形态正常，肝细胞索清晰可见。模型组小鼠肝脏组织血管周围有明显胶原纤维沉积，呈蓝色，肝小叶发生融合，假小叶形成，并伴有大量脂肪空泡。FTY720低和高剂量组纤维化程度明显减轻，纤维沉积程度减轻，无纤维间隔形成。见图2(插页三)。

表1各组小鼠血清ALT和 AST活性及肝脏指数

GroupDose(mg·kg-1)ALT[λB/(U·L-1)]AST[λB/(U·L-1)]HepaticindexBlankcontrol0.045.67±2.8233.16±2.420.055±0.001Model0.0244.55±12.72*173.33±9.14*0.087±0.002*FTY720 Highdose1.073.46±3.45△△52.24±2.79△△0.080±0.009△△ Lowdose4.062.12±2.12△△43.79±4.16△△0.073±0.003△

*P<0.01 compared with control group；△P<0.05 ，△△P<0.01 compared with model group.

3　讨　论

肝纤维化是慢性肝病发展进程中的重要病理表现，是肝硬化的前期病理阶段，是肝脏受到慢性损伤时细胞外基质(extracellular matrix，ECM)异常分泌并沉积在局部形成的可逆性创伤修复过程， 其进一步发展则会发展为不可逆转的肝硬化，肝硬化是慢性肝病最主要的致死原因[6-8]。目前在临床上对肝纤维化尚缺乏有效治疗手段，抗肝纤维化的药物包括拉米夫定、秋水仙碱、干扰素和肝细胞生长因子等，但均因疗效差且副作用大使其临床应用受限。如果能找到一种高效低毒的药物，可以阻断或逆转纤维化的进程，将给患者带来新的希望。因此积极探索肝纤维化发病机制，寻求有效治疗药物对降低肝硬化发病率和死亡率具有重要意义。

FTY720是传统中药冬虫夏草中提取的有效成分多球壳菌素，通过结构改造而合成的一种新型的免疫抑制剂，主要与淋巴细胞表面的鞘氨醇-1-磷酸受体(S1P1)结合，可介导淋巴细胞在外周淋巴器官、血液和淋巴液的运输[9-11]。FTY720的结构与鞘氨醇-1-磷酸(S1P)相似，可被细胞内鞘氨醇激酶2 (sphingosine kinase 2, Sphk2 )磷酸化为FTY720-P。FTY720-P与SIPR1结合后，导致鞘氨醇-1-磷酸受体1(SIPR1)被激活而内陷入细胞，细胞膜表面SIPR1减少导致其丧失对S1P的反应[12-13]。因此，FTY720可视为SIP1R的激动剂，拮抗SIP与受体结合的生物学作用，导致T和B淋巴细胞滞留在淋巴器官内，减少其在血液、淋巴液和黏膜等的分布以促进淋巴细胞归巢，抑制淋巴细胞增殖，目前主要用于器官移植和多发性硬化症的治疗[14]。与其他免疫抑制剂环孢素A和他克莫司等相比，FTY720的不良反应以及细胞毒性比较小，停药后淋巴细胞很快恢复到正常水平。为此，本实验建立ConA诱导的小鼠肝纤维化模型，观察其在肝纤维化防治中是否具有保护作用，为其成为防治肝纤维化的有效药物提供有利依据。

良好动物模型的建立是研究防治肝纤维化的基础，本研究采用小剂量Con A反复进行尾静脉注射诱导肝纤维化建立动物模型是较为经典的实验方法[15-20]。Con A是一种T细胞丝裂原，可刺激T细胞分裂并释放多种炎性细胞因子,引起T淋巴细胞介导的免疫性肝损伤。本实验采用的BALB/C小鼠是近交系小鼠，广泛应用于体外实验，对Con A反应明显，肝纤维化小鼠成模率较高，能够较好地反映肝纤维化阶段性病理改变。本实验采用10 mg·kg-1ConA 尾静脉注射，每周注射1次，9周后取血及肝组织行血清酶学和病理学观察。血清学检测显示：模型组 ALT 与 AST活性较空白对照组明显升高，FTY720低和高剂量组ALT和AST活性较模型组下降明显，FTY720高剂量组降低更为显著，但高于空白对照组，说明FTY720具有一定的抗肝损伤作用。HE染色结果显示：模型组肝细胞肿涨，胞质疏松，部分细胞呈气球样变，肝细胞索紊乱，炎症细胞浸润；FTY720组肝细胞形态大体正常，肝细胞索可见，略有紊乱，个别肝细胞肿涨及疏松，提示FTY720可减轻肝损伤程度。Masson 染色结果显示：模型组血管周围有明显纤维条束，肝小叶发生融合，假小叶形成。高剂量组纤维化程度明显减轻，纤维组织沉积减小。本实验结果表明：FTY720可明显阻断Con A诱导肝纤维化小鼠损伤程度，修复炎症损伤，有较明显的抗肝纤维化作用，可能与其减少血液中淋巴细胞的数量和抑制炎性细胞的浸润等有关，但其具体抗肝纤维化的作用机制尚需在以后的实验中加以阐明。

[1]孙颖，滕光菊，常彬霞，等.自身免疫性肝炎采用免疫抑制剂治疗的疗效预测[J].肝脏,2012，17(11)：803-807.

[2]Di Nuzzo L，Orlando R，Nasca C，et al. Molecular pharmacodynamics of new oral drugs used in the treatment of multiple sclerosis [J]. Drug Des Devel Ther，2014,8:555-568.

[3]周琬琦，张海婧，金晶，等. S1P1受体激动剂FTY720的免疫抑制作用[J].药学学报，2012，47(4) ：546-550.

[4]张雷，朱彤，孙尔维，等.FTY720作用机制及诱导移植免疫耐受的研究[J].中华外科杂志，2003，41(10)：773-777.

[5]Boldison J ，Chu CJ，Copland DA，et al.Tissue-resident exhausted effector memory CD8+T cells accumulate in the retina during chronic experimental autoimmune uveoretinitis[J]. J Immunol，2014,192(10)：4541-4550.

[6]姜慧卿，张晓岚.肝纤维化的发生机制[J]. 世界华人消化杂志,2000，8(6)：687-689.

[7]纪辉，迟宝荣，张一宁.肝纤维化与肝星状细胞[J]. 吉林大学学报：医学版，2008，34(3)：539-541.

[8]高润平，齐晓艳.肝纤维化的发生机制与治疗进展[J]. 世界华人消化杂志，2006，14(23)：2263-2269.

[9]Matsuda S，Minowa A，Suzuki S，et al. Differential activation of c-Jun NH2-terminal kinase and p38 pathways during FTY720-induced apoptosis of T lymphocytes that is suppressed by the extracellular signal-regulated kinase pathway[J].J Immunol,1999,162(6)：3321-3326.

[10]Guo R，Ma H， Gao F，et al. Metallothionein alleviates oxidative stress-induced endoplasmic reticulum stress and myocardial dysfunction [J].J Mol Cell Cardiol，2009，47(2) ：228-237.

[11]Ishitsuka A，Fujine E，Mizutani，et al.YFTY720 and cisplatin synergistically induce the death of cisplatin-resistant melanoma cells through the downregulation of the PI3K pathway and the decrease in epidermal growth factor receptor expression[J].Int J Mol Med，2014，34(4) ：1169-1174.

[12]Jiang J， Huang X， Wang Y，et al. FTY720 induces cell cycle arrest and apoptosis of rat glomerular mesangial cells [J]. Mol Biol Rep， 2012，39(8) ：8243-8250.

[13]Essis SA，Laurier-Laurin ME，Pépin É，et al. GluN2B-containing NMDA receptors are upregulated in plasma membranes by the sphingosine-1-phosphate analog FTY720P[J].Brain Res，2015，doi: 10.1016/j.brainres.2015.07.055. [Epub ahead of print].

[14]Endo H，Chihara N，Sekiguchi MDK. A case of multiple sclerosis who relapsed early after fingolimod therapy introduced [J]. Rinsho Shinkeigaku， 2015，55(6) ：417-420.

[15]郭若涵，白彬.大型动物实验性肝纤维化及肝纤维化模型的研究进展[J]. 世界华人消化杂志,2013，21(5)：421-426.

[16]李政通，李俊，黄成，等. CCI4诱导的大鼠肝纤维化模型肝纤维化逆转与MAPK信号通路的研究[J].中国药理学通报，2011，27(6)：809-814.

[17]王晓艳，万晓龙，郭晓燕，等.阿罗洛尔、普奈洛尔和卡维地洛对肝硬化大鼠门脉高压症的疗效比较[J].西安交通大学学报：医学版，2015，36(16)：730-734.

[18]王林，李波，耿智敏，等.索拉菲尼对肝星状细胞活性及活化的影响[J].郑州大学学报：医学版，2014，49(4)：501-504.

[19]李彬彬，明健，陈大贵，等.microRNA在肝纤维化进程中的作用[J].临床肝胆病杂志，2013，29(5)：385-388.

[20]陆伦根，李郑红.肝纤维化及肝硬化研究近况[J].临床肝胆病杂志，2013，29(5)：321-323.

Protective effect of FTY720 on hepatic injury in experimental hepatic fibrosis mice

ZHANG Chenhao， LI Yao，CHEN Wei， ZHAO Liangzhong，LI Yan

(Department of Pathogeny and Microbiology，School of Medical Laboratory，Jilin Medical University，

ObjectiveTo observe the protective effects of FTY720 on the Con A-induced mouse hepatic fibrosis injury, and to find the possible mechanisms of protective effects.MethodsThe pathologic models of hepatic fibrosis injury in the mice caused by Con A were set up.Forty mice were randomly divided into control group, model group, high dose of FTY720(4 mg·kg-1) group and low dose of FTY720 (1 mg·kg-1) dose group (n=10). The serum alanine aminotransferase(ALT) and asparate aminotransferase (AST) activities, hepatic index and pathological changes of hepatic tissue were detected .Results Compared with model group, the serum ALT and AST activities in low and high doses of FTY720 groups were decreased significantly (P< 0.05 orP< 0.01). The optical microscope results showed that there were inflammatory cells and hepatocellular necrosis in model group. The masson staining results showed that there were surrounding fiber bundle and hepatic lobule fusion in model group; compared with model group, the damage degree in low and high doses of FTY720 groups was reduced. The protective effects of FTY720 on hepatic injury showed linear relation to the drug dose.Conclusion FTY720 could decrease the levels of ALT/AST, thus FTY720 alleviate hepatic damage degree and delay the process of hepatic fibrosis.The protective effects of FTY720 on hepatic injury in experimental hepatic fibrosis mice may be related to the mechanisms mentioned above.

FTY720；concanavalin A；hepatic fibrosis；hepatic injury；animal model

1671-587Ⅹ(2015)06-1154-04

10.13481/j.1671-587x.20150611

2015-07-19

国家自然科学基金资助课题(82102953)；吉林省科技厅中青年科技创新领军人才及团队资助课题(20130521018JH)；吉林省科技厅重点科技攻关项目资助课题(20140203012YY)；吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目资助课题(2012第487号)；吉林省卫生厅重点专科项目资助课题(2013Z091)

张宸豪(1972-)，男，吉林省吉林市人，副教授，医学博士，主要从事抗感染及免疫方面的研究 。

李妍，教授，硕士研究生导师(Tel:0431-64500461,E-mail: liyan@jlmpc.cn)

R392.12；R-332

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