苯肾上腺素对大鼠成骨细胞放射损伤的保护作用

韩立赤，王雪红，董　会，汪义菲，张福胤，向　彬

(1.大连大学医学院口腔医学系，辽宁 大连 116622；2.大连医科大学附属第一医院口腔颌面外科，辽宁 大连 116011；3.大连医科大学附属第二医院口腔颌面外科，辽宁 大连 116023)

苯肾上腺素对大鼠成骨细胞放射损伤的保护作用

韩立赤1，王雪红1，董会2，汪义菲1，张福胤3，向彬1

(1.大连大学医学院口腔医学系，辽宁 大连 116622；2.大连医科大学附属第一医院口腔颌面外科，辽宁 大连 116011；3.大连医科大学附属第二医院口腔颌面外科，辽宁 大连 116023)

目的：探讨苯肾上腺素对放射损伤大鼠成骨细胞的细胞形态以及烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)mRNA表达水平的影响，阐明苯肾上腺素对其可能的保护作用机制。方法：组织块法培养大鼠颅骨成骨细胞，随机分为空白对照组、苯肾上腺素组、单纯照射组和苯肾上腺素+照射组。苯肾上腺素组在照射前0.5 h以100 mmol·L-1苯肾上腺素孵育成骨细胞，照射组给予成骨细胞8 Gy X射线照射。照射后8、16、32和64 h在倒置显微镜下观察并分别收集细胞，提取细胞总RNA，应用RT-PCR法检测成骨细胞Nampt mRNA表达水平。结果：倒置显微镜下，与空白对照组比较，苯肾上腺素组成骨细胞形态、数量未见明显改变；单纯照射组细胞形态发生明显皱缩，尤以8 h明显，细胞数量在8、16、32和64 h时分别是对照组的0.82、0.37、0.24和0.21倍；苯肾上腺素+照射组在照射8和16 h后细胞皱缩，32 h后其形态恢复，在8、16、32和64 h后其数量分别为空白对照组的0.91、0.83、0.72和0.75倍，是单纯照射组的1.09、2.24、3.00和3.60倍。RT-PCR法检测，在照射8、16、32和64 h后，单纯照射组、苯肾上腺素+照射组Nampt mRNA表达水平较空白组明显减少(P<0.01)，苯肾上腺素+照射组较单纯照射组明显增加(P<0.01)。结论：苯肾上腺素可减轻电离辐射导致的大鼠成骨细胞萎缩，并上调Nampt mRNA表达水平，其对成骨细胞放射损伤的保护作用可能与上调Nampt mRNA表达水平有关。

成骨细胞；电离辐射；苯肾上腺素；烟酰胺磷酸核糖转移酶

放射治疗为头颈部恶性肿瘤治疗的主要手段之一。放射治疗时X射线在杀伤恶性肿瘤细胞的同时，亦可引起颌骨组织纤维化、放射性骨坏死和病理性骨折等并发症，严重影响患者生活质量[1-2]。临床对上述并发症多采用高压氧、药物及手术等方法治疗[3-4]，但疗效并不令人满意。本课题组前期研究[5-6]结果显示：苯肾上腺素通过活化α1-肾上腺素受体(α1-adrenoceptor,α1-AR)对放射损伤的大鼠颌下腺具有细胞保护作用；然而，α1-AR对放射引起骨损伤的作用尚未见相关报道。烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase,Nampt)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)生物合成途径的关键限速酶，通过调节机体或细胞的NAD+水平以及其他非酶机制等途径影响代谢，炎症反应，细胞的增殖、分化、凋亡和衰老等诸多过程[7-9]。苯肾上腺素对放射损伤的颌骨组织中Nampt的影响未见文献报道。本研究通过研究苯肾上腺素对放射性损伤大鼠成骨细胞的作用及其对Nampt基因表达水平的影响，为探讨防治放射性颌骨损伤的新方法提供依据。

1　材料与方法

1.1动物、主要试剂和仪器实验用SD大鼠乳鼠由大连医科大学动物实验中心提供，动物合格证号：0001648；胰酶、DMEM高糖培养液和优质胎牛血清(Hyclone公司，美国)，Trizol(Invitrogen公司，美国)，Revert Aid First Stand cDNA Synthesis Kit (Fermentas公司，美国)，2×Taq PCR Master Mix(天根生化科技有限公司)；低温高速离心机(型号：5417R，Thermo公司，美国)，倒置显微镜 (Olympus公司，日本)，直线加速器(型号：23EX，Varian公司，美国)，PCR仪(型号：TC-615，TECHNE公司，英国)，核酸/蛋白分析仪(型号：3S，Thermo BioMate公司，美国)。

1.2大鼠成骨细胞培养新生1～2 d龄SD大鼠乳鼠推颈处死，无菌条件下取颅盖骨，去除骨膜及骨缝软组织，用PBS缓冲溶液洗3次，剪成1 mm×1 mm×1 mm大小碎片，均匀铺于培养瓶底，间距约5 mm。轻轻将培养瓶翻转，瓶底朝上放于37℃、5% CO2培养箱内；4 h后将培养瓶缓慢翻转平放，向瓶内加入5 mL含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液，静止培养。倒置显微镜下观察成骨细胞生长状况。待细胞长满培养瓶底80%以上，用0.25%胰酶消化传代。

1.3大鼠成骨细胞鉴定原代成骨细胞至第7天传代培养，倒置显微镜下观察并摄片。钙结节染色：取第3代大鼠成骨细胞培养20 d后，于盖玻片上镜下见细胞聚集成不透明区域，呈结节样。取出盖玻片，以95%乙醇固定10 min，0.1%茜素红染色，37℃温箱孵育30 min，蒸馏水冲洗，干燥，甘油明胶封片。

1.4实验分组和处理将传至第3代16瓶成骨细胞随机分为4组：空白对照组、苯肾上腺素组、单纯照射组和苯肾上腺素+照射组(照射前0.5 h给予终浓度为100 mmol·L-1苯肾上腺素)。应用直线加速器给予单纯照射组和苯肾上腺素+照射组成骨细胞8 Gy X射线照射。

1.5成骨细胞形态和数目观察在照射后8、16、32和64 h利用倒置显微镜下观察细胞生长状况，比较不同时间点的细胞形态学及数目差别。

1.6RT-PCR法检测各组大鼠成骨细胞Nampt mRNA表达水平分别于照射后8、16、32和64 h时间点收集成骨细胞于10 mL EP管中，Trizol法提取细胞总RNA。取2 μg RNA进行RT-PCR法检测。根据GenBank中大鼠Nampt全基因序列(基因登录号：NM-177928)设计引物。Nampt：上游引物为5′-GGCTACGTGGACGAC-

GACAC-3′，下游引物为5′-TCTGGTCCGGACGTCCCCTAC-3′，扩增片段大小为640 bp。内参β-actin：上游引物为5′-TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA-3′，下游引物为5′-GTTCTAGTAACGAGGAGGACT-3′，扩增片段大小为302 bp。PCR 扩增循环：94℃、30 s，54℃、60 s 和72℃、60 s；35个循环后72℃、5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，DNA green结合后于紫外灯下观察。UVP BioChemi System 荧光凝胶成像系统拍照，用Quantity One 4.6.2 软件检测条带，各样本RNA表达水平以吸光度(A)值表示,按照下列公式计算Nampt RNA表达水平并进行统计学分析。Nampt RNA表达水平=每个样本条带A值/β-actin A值。

2　结　果

2.1大鼠颅骨成骨细胞原代培养和鉴定组织块法原代培养大鼠成骨细胞，培养2 d后于倒置显微镜下观察可见：有细胞从组织边缘爬出，细胞形态多样，呈不规则形、三角形和梭形等，细胞有长短不一的突起且相互连接，胞质丰富，胞核清晰可见(图1A，见插页一)。待细胞长满瓶底80%开始传代，传代后4～5 d进入指数生长期，呈集落样生长趋势，汇合处呈铺路石状。细胞呈复层式生长，密集处细胞形态不明显，分界模糊。取第3代细胞培养20 d后，镜下见细胞形成集落，聚集成不透光的矿化结节(图1B，见插页一)。不透明结节行茜素红染色,呈橙红色着色(图1C，见插页一)。

2.2各组大鼠颅骨成骨细胞形态及数目倒置显微镜下观察可见：苯肾上腺素组细胞形态、数量与空白对照组比较未见明显改变；单纯照射组细胞形态发生皱缩，尤以照射8 h后明显，细胞数量在照射8、16、32和64 h后分别是对照组的0.82、0.37、0.24和0.21倍；苯肾上腺素+照射组在照射8和16 h后细胞皱缩，较单纯照射组轻微，且于照射32和64 h后细胞形态恢复(图2，见插页一)，在照射8、16、32和64 h后的细胞数量分别为空白对照组的0.91、0.83、0.72和0.75倍，是单纯照射组的1.09、2.24、3.00和3.60倍。

2.3各组大鼠颅骨成骨细胞Nampt基因的表达在照射8、16、32和64 h后，单纯照射组Nampt mRNA表达水平均较空白对照组减少(P<0.01)；苯肾上腺素+照射组Nampt mRNA表达水平较对照组减少(P<0.01)，但均较单纯照射组增加(P<0.01)。见图3和表1。

Lane 1:Control group; Lane 2:Phenylephrine group; Lane 3:Simple irradiation group; Lane 4:Phenylephrine+irradiation group.

图3各组大鼠成骨细胞中Nampt mRNA 表达电泳图

Fig.3Electrophoregram of expressions of Nampt mRNA in osteoblasts of rats in various groups

3　讨　论

在头颈恶性肿瘤中应用放射治疗可产生放射性骨坏死和病理性骨折等严重的并发症，这些延迟的放射性损伤造成的创口迁延不愈，给患者带来极大的痛苦[1-2,10]。寻找行之有效的预防放射性颌骨损伤的药物靶点具有重要的理论及临床意义。

苯肾上腺素是α1-AR特异性激动剂，作为血管活性药物为临床常用，用于升高血压、减慢心率及抗休克等治疗。越来越多的研究[5-6,11]显示：苯肾上腺素对涎腺辐射损伤具有保护作用。本课题组前期研究[5-6,12]亦发现：苯肾上腺素可以促进早期放射损伤大鼠颌下腺细胞增殖，并抑制颌下腺细胞凋亡。Vasin等[13]的研究发现：苯肾上腺素在放疗中对皮肤具有保护作用；Fahl[14]发现：放射前局部应用苯肾上腺素可以防止口腔黏膜炎的发生，并且不影响X射线对癌细胞的杀伤效果。苯肾上腺素是否对放射损伤的成骨细胞具有保护作用及其相关机制尚无文献报道。本实验采用新生大鼠的颅骨分离成骨细胞，培养的细胞具有典型的成骨细胞的形态学特征。8 Gy X射线照射大鼠成骨细胞后，单纯照射组细胞发生明显皱缩，且成骨细胞数目明显减少；而苯肾上腺素+照射组成骨细胞皱缩减轻，在照射32 h后形态恢复正常，数目也较单纯照射组细胞数目明显增多。本实验首次发现苯肾上腺素可减轻大鼠成骨细胞的放射性损伤。

表1　大鼠成骨细胞照射后不同时间点RNA灰度值

*P<0.01 compared with control group;△P<0.01 compared with simple irradiation group.

电离辐射一方面直接作用于DNA、蛋白质及酶类物质破坏细胞结构，另一方面作用于组织中的水分子，使其电离产生自由基，间接致细胞变性、坏死。Nampt具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性，与前B细胞克隆增强因子或内脏脂肪素的cDNA基因序列相同；在许多组织细胞的生理及病理过程中起到重要的调节作用，作为具有免疫调节功能的炎症细胞因子参与急慢性炎症反应，也起到NAD+合成中限速酶的作用。NAD作为一种辅酶调节众多的酶活性，以控制一系列的生理过程。Revollo 等[15]发现：在哺乳动物细胞中Nampt过表达可使NAD 水平提高55%。研究者[9,16]认为：Nampt通过增加细胞NAD+水平,进而提高SIRT1活性，促进细胞存活。

综上所述，Nampt促细胞存活的作用已得到越来越广泛的关注。本实验RT-PCR结果从基因水平证实放射损伤可使大鼠成骨细胞Nampt mRNA表达水平下调，而苯肾上腺素能够上调Nampt mRNA表达水平。苯肾上腺素对放射损伤成骨细胞的保护作用机制可能与增加成骨细胞中Nampt mRNA表达水平有关。然而，苯肾上腺素上调成骨细胞Nampt mRNA表达水平的相关受体后信号转导途径尚待进一步研究。

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Protective effect of phenylephrine on irradiated injury of osteoblasts in rats

HAN Lichi1,WANG Xuehong1,DONG Hui2,WANG Yifei1,ZHANG Fuyin3,XIANG Bin1

(1. Department of Oral Medicine,College of Medical Sciences,Dalian University,Dalian 116622,China;2. Department of Oral and Maxillofacial Surgery,First Affiliated Hospital,Dalian Medical University,Dalian 116011,China;3. Department of Oral and Maxillofacial Surgery,Second Affiliated Hospital,Dalian Medical University,Dalian 116023,China)

ObjectiveTo investigate the effect of phenylephrine on the morphology and the expression level of Nampt mRNA in the irradiated osteoblasts of the rats,and to clarify the possible protective effects of phenylephrine on this injury.MethodsThe osteoblasts cultured by conventional tissue were randomly divided into control group, phenylephrine group,simple irradiation group,and phenylephrine+irradiation group.The cells in phenylephrine group were treated with 100 mmol·L-1phenylephrine 30 min before irradiation.The cells in simple irradiation group were irradiated with 8 Gy X-ray.The osteoblasts were observed by microscope and were collected at the time points of 8,16,32 and 64 h after irradiation.The Nampt mRNA expression level in osteoblasts was examined by RT-PCR.ResultsThere was no obviously morphological and number changes of osteoblasts in phenylephrine group compared with control group.The osteoblasts in simple irradiation group were atrophied,especially at 8 h; the number of osteoblasts in simple irradiation group was 0.82,0.37,0.24 and 0.21 times as control group respectively at 8,16,32 and 64 h. Atrophy of osteoblasts was alleviated in phenylephrine+irradiation group; at 8,16,32 and 64 h,the number of osteoblasts was 0.91,0.83,0.72 and 0.75 times as control group,and was 1.09,2.24,3.00 and 3.60 times as simple irradiation group.The expression level of Nampt mRNA in the osteoblasts in simple irradiation group was reduced compared with control group(P<0.01)at 8,16,32 and 64 h. There were significant differernces of the expression levels of Nampt mRNA in the osteoblasts between phenylephrine+irradiation group and control group(P<0.01),and there were significant differernces between phenylephrine+irradiation group and simple irradiation group(P<0.01)at the different time points.ConclusionPhenylephrine could reduce the atrophy of osteoblasts in the rats induced by irradiation and up-regulate the expression level of Nampt mRNA.Its protective effect on irradiated injury may be related to the up-regulation of the expression level of Nampt mRNA.

osteoblast; irradiation; phenylephrine;nicotinamide phosphoribosyltransferase

1671-587Ⅹ(2015)06-1113-05

10.13481/j.1671-587x.20150603

2015-04-13

国家自然科学基金资助课题(81170978，81371161)；辽宁省科技厅自然科学基金资助课题(201202008)；大连大学本科生创新教育基金项目资助课题(2013112)

韩立赤(1970-)，女，辽宁省台安县人，副主任医师，医学博士，主要从事口腔正畸基础及临床方面的研究。

韩立赤，副主任医师，硕士研究生导师(Tel: 0411-87412315, E-mail: hanlichi@dlu.edu.cn);

向彬，教授，硕士研究生导师(Tel: 0411-87402916, E-mail: xiangbin@dlu.edu.cn)

R881.7

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