IL-2通过Jak3-Stat5通路促进巨噬细胞M1极化

亓文静，李 岩，王 玉，于爱莲

(泰山医学院基础医学院病原生物学研究所，山东泰安271000)

IL-2是免疫系统中多效能的细胞因子，对巨噬细胞和单核细胞有激活作用［1］。IL-2在病毒性感染，恶性肿瘤和其他疾病中具有重要临床价值。

巨噬细胞极化是一异质过程，不同极化产生不同功能的活化细胞。根据表型和分泌的细胞因子，可将其激活分为经典活化(classically-activated，M1)和选择活化(alternatively-activated，M2)，不同活化诱导不同的胞内信号。常见M1型标志物:IFN-γ、IL-1β、IL-12、IL-23及 TNF-α 等;M2 型标志物有:Arginase-1、CD163、IL-10、IL-4R1 及 TGF-β 等［2］。巨噬细胞极化是多因子相互作用的复杂过程，受到胞内多种分子及通路的调控。

IL-2能够有效激活、提高巨噬细胞的吞噬及杀伤活性［3-4］。但IL-2对巨噬细胞极化及其机制很少有报道。IL-2同家族的IL-4，已被证实能够促使M0向M2极化［5］。因此，本研究拟通过与IL-4作用的对比，探求IL-2在调控巨噬细胞极化中的作用及其所涉及的通路。

1 材料与方法

1.1 材料

小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7(中国科学院细胞库);重组小鼠白介素-2(rmIL-2)和重组小鼠白介素-4(rmIL-4)(Sigma公司);Trizol、反转录试剂盒、SYBR-Green荧光染料［宝生物工程(大连)有限公司］;引物由上海生工生物工程技术服务公司合成;蛋白裂解液RIPA、PMSF蛋白酶抑制剂和BCA蛋白定量试剂盒(碧云天生物技术研究所);anti-F4/80-PE，anti-CD206-APC(eBbioscience)和 anti-CD11c-FITC(Biolegend)(达科为公司);anti-iNOS(sc-650)和anti-Arg-1(sc-20150)(Santa Cruz公司);anti-Phospho-Stat5(p-Stat5，#4322)，anti-Stat5(#9358)，anti-Phospho-Jak3(p-Jak5，#5031)，anti-Jak3(#8863)和辣根过氧化物酶标记的二抗(Cell Signaling Technology公司);ECL Plus发光液(Millipore公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与处理:巨噬细胞RAW 264.7培养于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液中，37℃，5%CO2培养，0.05%胰蛋白酶消化传代，传至3～8代内用于实验。重组细胞因子rmIL-2(IL-2)和rmIL-4(IL-4)对细胞的处理浓度均为20 ng/mL，对照组处理采用同样浓度的BSA。

1.2.2 实时荧光定量real-time PCR:细胞经处理后，Trizol法提取总 RNA，按反转录试剂盒说明操作，1 μg RNA反转获得 cDNA第一链。Real-time PCR SYBR Green试剂盒检测各目的基因的mRNA水平，各基因引物序列见表1。检测仪器为:ABI 7300 real-time PCR仪。反应条件(二步法):95℃15 s，60 ℃ 45 s，45 循环。采用 2-ΔΔCT法计算目的基因与内参基因β-actin的相对表达量。

1.2.3 流式细胞术:RAW 264.7细胞经IL-2(20 ng/mL)和IL-4(20 ng/mL)处理24 h后，分别用F4/80-PE和 CD11c-FITC标记 M1型细胞，以F4/80-PE和CD206-APC标记M2型细胞，运用流式细胞仪FACSCalibur(BD Biosciences)检测，以Cell Quest软件分析10 000个细胞样品。

1.2.4 Western blot:细胞处理完成后，消化收集各培养板细胞，1 500 r/min离心5 min，PBS洗3次，加入适量预混PMSF的RIPA蛋白裂解液，冰浴裂解15 min，12 000 r/min离心10 min后取上清。BCA法蛋白定量，与适量比例的上样缓冲液混合后，煮沸10 min。

等量蛋白(40 μg)上样于12%SDS-PAGE胶中分离，之后将蛋白转印至硝酸纤维素膜上，5%脱脂牛奶粉封闭1～2 h后，4℃孵育一抗过夜，次日，TBST洗膜，10 min/次，共洗3次，常温孵育辣根过氧化物酶标记的二抗，TBST洗膜，10 min/次，共洗3次，化学发光底物(ECL Plus发光液)，曝光。Gel Pro Analyzer软件处理条带吸光度值。

表1 细胞因子引物序列Table 1 Real-time PCR primer sequences of oytokines

1.3 统计学分析

统计分析及作图使用SPSS 18.0软件及Graph-Pad Prism 5.0软件进行。计量资料采用均数±标准差±s)表示。组间比较采用单因素方差分析或配对样本t检验。

2 结果

2.1 IL-2诱导巨噬细胞RAW 264.7表达M1型标志分子表达上调

在IL-2处理组，IL-1β的mRNA水平随处理时间延长而表达上调，在24 h表达量最高，而IL-10的mRNA水平在IL-2处理前后未发生改变(图1A);在IL-4处理组，IL-10的mRNA水平随处理时间延长而逐渐表达上调，而IL-1β的表达水平未出现显著性差异(图1B)。

IL-2和 IL-4诱导处理24 h后，TNF-α、IL-12和M2标志性分子CD163表达水平检测结果显示，IL-2能够引起TNF-α和IL-12的mRNA水平分别升高16.36和6.63倍，而CD163表达未改变(图2A);IL-4诱导引起了TNF-α和CD163 mRNA表达分别升高2.3倍和4.27倍(图2B)。

图3显示，IL-2能够引起M1型标志分子iNOS蛋白水平显著上调，而IL-4能够上调M2型分子Arg-1的蛋白水平。

2.2 IL-2诱导巨噬细胞RAW 264.7向M1极化

IL-2处理后，M1型巨噬细胞比例上升到24.6%，显著高于M2型的10.6%;与此相对应，IL-4处理后，M2型巨噬细胞比例上升到26.8%，显著高于M1型的9.4%(图4)。提示:IL-2能够体外诱导巨噬细胞RAW 264.7由M0向M1极化。

图1 IL-2或IL-4作用RAW 264.7细胞不同时间点，IL-1β和IL-10的mRNA表达水平检测Fig 1 The mRNA levels of IL-1β and IL-10 in RAW 264.7 cells treated with IL-2 or IL-4 for indicated time points

图2 IL-2或IL-4刺激RAW 264.7细胞24 h后，巨噬细胞M1型和M2型标志分子的mRNA表达水平Fig 2 The mRNA levels of M1 and M2 macrophages markers in RAW 264.7 cells after treated with IL-2 or IL-4 for 24 hours

图3 IL-2或IL-4诱导巨噬细胞M1型标志分子iNOS和M2型标志分子Arg-1蛋白水平的检测Fig 3 The protein levels of iNOS and Arg-1 were detected by Western blot

图4 流式细胞术检测巨噬细胞RAW 264.7的分型Fig 4 The phenotype of macrophage RAW 264.7 were detected by Flow cytometry

2.3 IL-2通过激活Jak3-Stat5信号通路诱导巨噬细胞RAW 264.7极化

Western blot方法检测Jak3和Stat5的磷酸化及总的蛋白表达，结果显示，在IL-2处理后，Jak3和Stat5分子的磷酸化水平分别增高3.2和2.6倍(P＜0.01)，而其总蛋白水平没有改变(图5)。提示:Jak3-Stat5信号可能通路参与了IL-2诱导巨噬细胞的M1型极化作用。

3 讨论

巨噬细胞是固有免疫系统的重要成分，在机体的炎性反应、代谢及肿瘤微环境形成等生理过程中发挥重要作用，是针对不同环境因子产生的应答机制。巨噬细胞存在M1和M2两种极化类型［6］，M1型细胞表现为促炎性反应和抗原提呈作用等，而M2型主要存在于肿瘤微环境中，主要抑制炎性反应，促进组织修复和纤维化等［7］。研究表明，IL-2可显著促进巨噬细胞分泌TNF-α，IL-1和NO等细胞因子，增强巨噬细胞对病原微生物或肿瘤细胞的杀伤作用［4］。然而，关于IL-2对巨噬细胞极化调节及其机制，至今尚未明确。

图5 Western blot检测IL-2对Jak3-Stat5信号通路激活Fig 5 The effects of IL-2 on Jak3-Stat5 signaling pathway were detected by Western blot

原始RAW 264.7细胞通常被认作M0型巨噬细胞。经IL-4作用，M0被诱导为M2［5］;而经 LPS刺激，M0极化为M1［8］。本研究采用重组IL-2诱导RAW 264.7细胞，发现IL-2能够上调表达M1型标志分子的表达，而对M2型标志分子的表达无影响;之后采用流式细胞术进一步确认，IL-2能够诱导M0向M1极化。结果显示，相比于IL-4可诱导分泌M2型标志性分子，IL-2能够体外诱导M1型标志分子。再者，最新研究证明，IL-2能够促使IFN-γ的合成与分泌，IFN-γ 调节巨噬细胞向 M1型极化［9］，亦间接证实本研究结果。

巨噬细胞极化是多因子多通路共同调控的结果，目前对其极性转换的具体机制仍未完全明确。有研究指出，IL-4能够通过激活Jak-Stat6通路，实现对巨噬细胞M2极化及相关标志分子的诱导［10］。IL-2及其受体γ是Jak3信号通路激活的基本条件;敲除IL-2受体γ即可阻滞其下游Stat5和MAPK等分子的磷酸化及表达［11］。作为Stat5的众多配体之一，IL-2能够在Tyr694位点使Stat5磷酸化，继而促使其激活［12］;再者，在人DC细胞中，IL-2能够上调p-Stat5［9］。因此，本研究选择检测IL-2作用后Jak3和Stat5的活化程度。结果发现，IL-2作用后，Jak3和Stat5总蛋白水平没有改变，而其磷酸化水平显著提高，提示IL-2能够激活Jak3-Stat5通路。

本实验报道了IL-2具有促进巨噬细胞由M0向M1型极化的功能，并初步探究IL-2可能是通过Jak3-Stat5信号通路，实现对巨噬细胞极化的调控。从而将为继续研究IL-2的功能多样性，或深入探讨巨噬细胞极化的机制，增添新的研究资料和研究思路，同时也为机体免疫调控网络的研究提供重要参考价值。

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