银杏叶提取物对家兔高胆固醇血症模型脑组织形态学的影响*

高　青，马东明，胡先同，卢　斌，张瑞峰，冯玉陶，姜希娟（.天津中医药大学中西医结合学院，天津009；.新泰市中医院病理科，新泰700；.天津武警后勤学院附属医院中医科，天津006）

银杏叶提取物对家兔高胆固醇血症模型脑组织形态学的影响*

高青1，马东明1，胡先同1，卢斌1，张瑞峰2，冯玉陶3，姜希娟1
（1.天津中医药大学中西医结合学院，天津300193；2.新泰市中医院病理科，新泰271200；3.天津武警后勤学院附属医院中医科，天津300162）

［目的］通过高胆固醇血症家兔模型观察银杏叶提取物（EGB761）对中枢神经纤维的影响。［方法］以成年雄性新西兰大白兔复制高胆固醇血症模型，实验分为4组：对照组、模型组、阳性药辛伐他汀组、EGB761组。用苏木精-伊红（HE）染色和嗜银染色法观察神经元及神经纤维的形态学改变。［结果］外周胆固醇升高时，模型组海马出现较多神经元变性、坏死，神经纤维缠结等病理改变。EGB761组变性、坏死的神经元明显少于模型组，细胞核形态基本规则，嗜神经现象少见，神经纤维缠结少于模型组。［结论］EGB761可有效保护高胆固醇血症时神经纤维结构的完整性。

银杏叶提取物；高胆固醇血症；神经纤维

DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2015.03.09

传统观点认为血液中的胆固醇不能穿过血脑屏障，因此无法影响脑胆固醇的含量。近来研究表明高胆固醇饮食与阿尔兹海默症（AD）有密切关系，高胆固醇血症的个体具有更高的AD易感性［1］。AD是一种以记忆障碍为主，并伴有其他认知和精神行为异常为临床表现的的疾病，是人类最常见的神经退行性疾病，病变部位主要在大脑皮质及海马区域。银杏叶作为防治神经退行性疾病的主要药物，可以有效降低外周胆固醇水平大量临床观察发现银杏内酯B对AD疗效确切，前期研究表明它对离体高胆固醇损伤海马神经元存在明确保护作用，同时可以降低神经元内胆固醇水平，干预神经元胆固醇代谢［2-3］。本实验通过复制新西兰兔高胆固醇血症模型，进行苏木精-伊红（HE）染色及Glees银染，观察高胆固醇血症对皮质及海马的形态学影响及银杏叶提取物（EGB761）的干预作用。

1　材料和方法

1.1实验动物选择健康成年雄性新西兰大白兔共39只，体质量为（2 356±212）g，由军事医学科学院实验动物中心提供。

1.2方法

1.2.1复制高胆固醇血症动物模型所有家兔均给予普通饲料和自来水适应喂养2周，饲养条件为温度（28±2）℃，湿度为37%～48%。2周之后，从中随机取出9只作为对照组，仍然饲以普通饲料及蒸馏水，直到实验结束，共需9周。其余30只家兔均采用D.Larry Sparks［4］的造模方法进行高胆固醇血症家兔的造模，即用2%的高胆固醇饲料喂养。高胆固醇饲料的配比为：4%的胆固醇、4%的花生油、92%的基础饲料。具体饲养方法如下：因家兔不喜进食高胆固醇饲料，故每日早晨每只家兔均先饲以50 g高胆固醇饲料，待其全部吃完后再饲以50 g的普通饲料，饮水用蒸馏水。6周之后，通过家兔耳缘静脉空腹取血，通过测定其血清总胆固醇的含量来验证造模是否成功。

1.2.2筛选动物模型高胆固醇饲料喂养的30只家兔在6周后通过耳缘静脉空腹取血，用半自动生化分析仪测定血清总胆固醇的含量。血清总胆固醇若高于1 400 mg/dL，则提示高胆固醇血症模型复制成功，同时淘汰血脂未达到1 400 mg/dL的家兔。

1.2.3实验分组及给药方法正常对照组之外的30只家兔造模成功28只，淘汰2只，将28只造模成功的家兔按随机数字表法随机分为3组，即模型组（n=9）、阳性药辛伐他汀组（n=8）、EGB761组（n= 11）。之后模型组和EGB761组又因高胆固醇血症导致脑部疾患各死亡1只，因此最终模型组（8只）、阳性药辛伐他汀组（8只）、EGB761组（10只）。模型组在6周后继续给予高胆固醇饲养3周（由于停用胆固醇饲料后，家兔血胆固醇水平会很快降低，故须继续给予高胆固醇饲料）。阳性药辛伐他汀组给予辛伐他汀每日5mg/kg灌胃3周，其余处理同模型组。EGB761组每日给予EGB761 50 mg/kg灌胃3周，其余处理同模型组。以上各组饮水仍用蒸馏水，上述药物剂量是按照成人体表面积折算的等效剂量。

1.2.4标本处理所有干预结束后，用生理盐水配置浓度为3%的戊巴比妥钠，经家兔耳缘静脉注射给药，待麻醉后将家兔固定于兔台之上。然后开胸，打开左心室，将输液器插入主动脉并用细线固定。剪开右心耳，用大量生理盐水灌流，将血液洗净。用骨钳开颅取脑，取出脑后，用镊子轻轻分离出海马和皮质，皮质要去掉白质和脑膜。然后将取出的一侧海马和皮质浸入10%甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，进行HE染色及Glees银染。

2　结果

2.1脑组织HE染色组织形态学观察正常对照组皮质及海马HE染色镜下显示：细胞核呈蓝色或深蓝色，细胞浆及其他组织呈粉红色。神经细胞排列紧密、整齐。细胞核形态规则，未见明显核固缩、肿胀等病理改变。模型组出现较多的细胞核消失，神经元变性、坏死、减少，且有嗜神经现象。银杏叶提取物EGB761组变性、坏死的神经元明显少于模型组，细胞核形态基本规则，嗜神经现象少见。辛伐他汀组的情况与银杏叶提取物EGB761组类似。见图1。

图1　HE染色结果Fig.1HE staining results

2.2脑组织Glees染色组织形态学观察镜下显示：正常对照组皮质及海马在黄色背景下，神经元轴突及神经纤维呈黑色，无神经元纤维聚集缠结等病理改变。模型组则出现较多神经元纤维聚集缠结的现象。银杏叶提取物EGB761组神经元纤维聚集缠结的现象少于模型组而多于正常对照组。辛伐他汀组的情况与银杏叶提取物EGB761组类似。见图2。

图2　Glees染色结果Fig.2　Glees staining results

3　讨论

外周胆固醇不能通过血脑屏障，对脑胆固醇含量无直接影响［5］。脑内胆固醇通过CYP-46代谢途径、载脂蛋白E结合途径、ATP结合盒转运体A1、类固醇激素合成急性调节蛋白、胆固醇酰基转移酶等转运途径维持平衡。脑胆固醇稳态的破坏将诱发多种神经系统疾病［6］。本实验结果显示高胆固醇血症可导致神经元的变性、坏死，出现嗜神经现象及较多神经元纤维聚集缠结的现象。表明外周胆固醇通过一定的机制破坏了神经纤维的正常组织结构。EGB761是中药银杏叶提取物标准制剂，具有调节血脂的功效，并可有效降低海马部位的血脑屏障的完整性［7-9］。通过银杏叶EGB761的干预后神经元变性、坏死明显减少，嗜神经现象及神经元纤维聚集缠结现象少见，与辛伐他汀组类似。表明EGB761有效保护了高胆固醇血症时神经纤维结构的完整性，具体机制有待进一步阐明。

［1］孙雯雯，颉宾芳，刘卉，等.高胆固醇血症在阿尔兹海默病发生中的作用及藏药柳茶提取物的治疗效应［J］.中药材，2012，35 （4）:569-602.

［2］姜希娟，卢斌，杨琳，等.银杏内酯B对胆固醇和载脂蛋白E4损伤海马神经元活性和生长的影响［J］.中国老年学杂志，2007，23（3）:203-205.

［3］姜希娟，杜云，杨琳，等.银杏内酯B对胆固醇和载脂蛋白E4损伤海马神经元凋亡的影响［J］.辽宁中医杂志，2007，34（3）: 371-373.

［4］Sparks DL，Kuo YM，Roher A，et al.Alterations of Alzheimer’s disease in the cholester-fed rabbit，including vascular inflammation［J］. Preliminary observations Ann N Y Acad Sci，2000，903:335-441.

［5］Griffiths WJ，Wang Y.Analysis of oxysterol metabolomes［J］.Biochim Biophys Acta，2011，1811（11）:784-799.

［6］和欣，郭振宇，孙红梅，等.胆固醇代谢异常与神经系统疾病关系的研究进展［J］.现代生物医学进展，2012，112（36）:7179-7181.

［7］马东明，张瑞峰，王强，等.银杏叶提取物EGB761对高胆固醇家兔肝质量和形态的影响［J］.天津中医药，2009，26（6）:493-494.

［8］王强，姜希娟，范英昌，等.银杏叶提取物EGB761对高胆固醇血症家兔血脑屏障通透性的影响［J］.天津中医药大学学报，2010，27 （1）:30-32.

［9］姜希娟，卢斌，马东明，等.银杏叶提取物EGB761对阿尔茨海默病家兔模型ACAT1和LCAT mRNA表达的影响［J］.天津中医药，2011，28（1）:59-60.

（本文编辑：马英，马晓辉）

Effect of the extract of Ginkgo Biloba in brain tissue morphology in rabbit hypercholesteremia model

GAO Qing1，MA Dong-ming1，HU Xian-tong1，LU Bin1，ZHANG Rui-feng2，FENG Yu-tao3，JIANG Xi-juan1
（1.School of Integrative Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.Department of Pathology，Xintai Hospital of Traditional Chinese Medicine，Xintai 271200，China；3.Department of Traditional Chinese Medicine，Affiliated Hospital of Tianjin Armed Police Logistics College，Tianjin 300162，China）

［Objective］To study the effect of the extract of Ginkgo Biloba 761（EGB 761）on brain tissue morphology in rabbit hypercholesteremia model.［Methods］We built the hypercholesteremia model with male New Zealand white rabbits，which were divided into four groups:the control group，the model group，the simvastatin group，the EGB761 group.Detecting the morphology change of nerve fiber with HE staining and silver staining.［Results］The hippocampus in model group showed neuronal degeneration，necrosis and microfibers tangles while the EGB761 group showed less neuronal degeneration，necrosis and microfibers tangles，and regular nuclear morphometry. ［Conclusion］EGB761 can effectively protect the integrity of the structure of nerve fibers in hypercholesterolemia.

extract of Ginkgo Biloba；hypercholesteremia；nerve fiber

R285.5

A

1672-1519（2015）03-0165-03

*资金项目：高校博士点专项基金资助项目（20101210120008）。

高青（1988-），女，硕士研究生，主要从事干细胞及心血管疾病方面的研究。

姜希娟，E-mail:xijuanjiang@foxmail.com。

（2014-11-03）