不同频率提插水沟穴对大鼠局灶性脑缺血再灌注皮质细胞凋亡及NF-κB p65、Caspase-3的影响*

沈　燕，王　永，李　卓，林海平，陈英英，王　舒（天津中医药大学第一附属医院针灸研究所，国家中医药管理局脑病针刺疗法研究室，国家中医药管理局针刺量效关系三级实验室，天津市针灸学重点实验室，天津300193）

·实验研究·

不同频率提插水沟穴对大鼠局灶性脑缺血再灌注皮质细胞凋亡及NF-κB p65、Caspase-3的影响*

沈燕，王永，李卓，林海平，陈英英，王舒
（天津中医药大学第一附属医院针灸研究所，国家中医药管理局脑病针刺疗法研究室，国家中医药管理局针刺量效关系三级实验室，天津市针灸学重点实验室，天津300193）

［目的］研究不同频率提插水沟穴对大鼠局灶性脑缺血再灌注皮质缺血区NF-κB p65和Caspase-3的影响，寻求适宜针刺频率。［方法］将成年Wistar雄性大鼠随机分为空白组、假手术组、模型组、水沟穴低频提插组、水沟穴中频提插组、水沟穴高频提插组，每组大鼠6只。空白组不造模，假手术组造模时在颈内动脉内不插入线栓，其余4组均完成局灶性脑缺血再灌注模型。空白组、假手术组和模型组均常规饲养，不进行针刺干预；水沟穴低频提插组、水沟穴中频提插组、水沟穴高频提插组均进行对应频率的针刺干预。每日两次，针刺3 d。TUNEL法检测各组大鼠皮质细胞凋亡的表达，免疫荧光检测大脑皮质NF-κB p65和Caspase-3的表达。［结果］皮质细胞凋亡的表达：各针刺组与模型组比较（P＜0.01）有统计学差异，针刺低频组和针刺中频组及高频组差异有均统计学意义（P＜0.01及P＜0.05），针刺中频组和高频组比较无统计学差异（P＞0.05））。大脑皮质NF-κB p65和Caspase-3的表达：各针刺组与模型组比较（P＜0.01）有统计学差异，针刺低频组和高频组有统计学差异（P＜0.01），针刺中频组和高频组比较无统计学差异（P＞0.05）。［结论］针刺各个频率组都可显著降低脑缺血再灌注损伤所致的细胞凋亡，其中针刺中频组和高频组要显著优于低频组，其可能与降低皮质细胞NF-κB p65和Caspase-3的表达量有关。

针刺；穴；水沟；局灶性脑缺血再灌注；刺激参数/针刺效应

DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2015.03.08

脑血管病是临床常见病、多发病，具有高发病率、高病死率、高致残率、高复发率的特点，严重危害人类的健康。脑组织细胞缺血以后，机体通过产生一系列复杂的病理生理变化，氧化应激反应，炎症细胞浸润，炎症因子进一步活化释放，加重脑组织损伤。大量研究证实，针刺对脑缺血损伤有明确的治疗作用。频率是针刺手法效应的两个最重要的刺激参数因素之一，本研究拟观察不同频率提插对大鼠局灶性脑缺血再灌注大脑皮质NF-κB p65和Caspase-3表达量的影响，以探讨适宜的针刺提插频率，为临床针刺手法标准化提供更多的实验依据。

1　材料和方法

1.1实验动物及分组实验选用健康成年Wistar雄性大鼠，体质量为200～250 g，由中国军事医学医学科学院实验动物中心提供（SPF级）。按照随机数字表法随机分为空白组、假手术组、模型组，每组6只，针刺组18只。实验动物于二级动物房饲养，室温（20～25℃），光照时间（07∶00～19∶00）自由摄食、饮水。针刺实验结束后，进行神经功能评分，针刺组再随机分为水沟穴低频提插组，水沟穴中频提插组、水沟穴高频提插组，每组各6只大鼠。手术和实验过程经天津中医药大学动物伦理委员会批准，所有动物实验均遵守相关规定进行处理。

1.2实验方法

1.2.1干预方法针刺组：大鼠水沟穴定位参照《实验针灸学》穴位标准。针具选用苏州医疗用品厂生产的“华佗牌”毫针，长4 cm，直径0.30 mm，水沟组大鼠朝向鼻中隔方向针刺2 mm。水沟穴各参数组于造模成功后开始针刺，提插操作频率分别为低频1次/秒、中频2次/秒，高频3次/秒。提插深度2 mm，针刺时间为60 s，每日2次，共3 d。其余各组均不实施针刺治疗。为保证针刺频率、深度、操作时间的可控性与稳定性，避免人工操作的误差，提插刺法操作由重庆海扶技术有限公司研制的针刺机械手完成。

模型组和假手术组：造模成功后相应时间段内，用与针刺组实施同等条件的抓取，但不实施任何针刺干预，72 h共抓取6次。

空白组：不造模型，与针刺组实施同等条件的抓取，但不实施任何针刺干预，72 h共抓取6次。

1.2.2大鼠局灶性脑缺血再灌注模型制作1）参照Zea Longa［1］线栓法加以改进制作大脑中动脉缺血再灌注模型（MCAO/R）。术前12 h对大鼠禁食，6 h禁水。10%水合氯醛腹腔注射麻醉（3 mL/kg体质量）。将大鼠仰卧位固定，线栓从颈外动脉至颈内动脉插入大脑中动脉，线栓深入颅内约18～20 mm。阻断2 h后，拨出线栓，完成缺血再灌注模型。假手术组除不插线栓外其余步骤同模型组和针刺组，正常组不做任何处理。2）神经功能评分具体采用Zausinger 6分法［2］：去除评分为0分、4分、5分及死亡的动物。3）整个造模过程中（正常组及假手术组除外）使用激光多普勒血流仪对大鼠脑血流进行实时监测，以线栓插入之前的脑血流值为基线，插入线栓后其脑血流值下降到基线的15%～30%，拔出线栓实现再灌注后脑血流有所恢复，则符合脑缺血及再灌注的脑血流要求。

1.2.3组织石蜡切片制备各组大鼠分别于再灌注72 h再次麻醉，经含4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲溶液（PBS，0.01 mol/L，pH7.4）灌注液心脏灌注固定后，取脑，以视交叉和其后4 mm处两点冠状切片，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切成4 μm厚的连续冠状石蜡切片备用。

1.2.4TUNEL凋亡细胞检测采用罗氏In site cell death detection kit（FITC）进行凋亡细胞检测，依照说明书依次将石蜡切片进行常规脱蜡和梯度酒精水化后，蛋白酶K溶液，室温孵育20 min，TdT平衡缓冲液，室温孵育10～30 min，含有FITC-12-dUTP标记混合物的TdT孵育缓冲液，37℃孵育60 min，最后PBS漂洗终止反映，甘油封片后在荧光显微镜下观察细胞凋亡情况，每张切片取皮层缺血区5个不重复视野进行阳性细胞计数。

1.2.5免疫荧光染色石蜡切片进行常规脱蜡和梯度乙醇水化后，用枸橼酸修复液在微波炉中进行抗原修复；之后进行血清封闭（北京中衫封闭液）；滴加适宜浓度的一抗（santacruz；1∶200）置湿盒中4℃孵育过夜；滴加荧光二抗（santacruz）室温置湿盒中避光孵育1 h，用PBS 3 min×3次洗去二抗，用滤纸擦去标本外的PBS。最后用含甘油封片，并在荧光显微镜下立即观察。每只大鼠取1张石蜡切片，每张切片取皮质缺血区5个不同视野拍照后进行阳性细胞计数。

1.3统计学方法应用SPSS 18.0进行统计分析，所有数据采用均数±标准差

2　结果

2.1TUNEL法检测各组大鼠皮质细胞凋亡的表达结果显示：空白组及假手术组少有细胞凋亡的表达，而模型组则有大量的凋亡细胞表达，通过针刺治疗后则发现凋亡细胞数量明显减少。对各组大鼠皮质的细胞凋亡进行统计分析：模型组与空白组、假手术组比较（P＜0.01）有统计学差异，模型组大鼠大脑皮质的细胞凋亡数量明显多于空白组和假手术组；各针刺组与模型组比较（P＜0.01）有统计学差异，针刺组治疗后大鼠大脑皮质的细胞凋亡数量比模型组大鼠明显减少；水沟低频组和水沟中频组，以及高频组均有统计学差异（P＜0.01或P＜0.05），水沟中频组和高频组比较无统计学差异（P＞0.05）。见表1。

表1　各组大鼠皮质细胞凋亡的阳性表达比较Tab.1　Comparison of positive expression of cortical cell apoptosis of rats in each group

表1　各组大鼠皮质细胞凋亡的阳性表达比较Tab.1　Comparison of positive expression of cortical cell apoptosis of rats in each group

注：与空白组及假手术组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.01；与水沟低频组比较，△P＜0.05。

组别n阳性细胞空白组61.13±0.24假手术组64.43±1.42模型组674.37±2.45*水沟低频组648.63±4.37#水沟中频组636.20±2.79#△水沟高频组634.77±5.62#△

2.2免疫组化检测大脑皮质NF-κB p65的阳性表达实验结果显示，模型组与空白组、假手术组比较（P＜0.01）有统计学差异，模型组大鼠大脑皮质细胞NF-κB p65的阳性表达量明显多于空白组和假手术组；各针刺组与模型组比较（P＜0.01）有统计学差异，针刺组治疗后大鼠大脑皮质的细胞凋亡数量比模型组大鼠明显减少；水沟低频组和高频组有统计学差异（P＜0.01），水沟中频组和高频组比较无统计学差异（P＞0.05）。见表2。

表2　各组大鼠皮质细胞p65的阳性表达比较Tab.2　Comparison of positive expression of p65 cerebral cortex of rats in each group

表2　各组大鼠皮质细胞p65的阳性表达比较Tab.2　Comparison of positive expression of p65 cerebral cortex of rats in each group

注：与空白组及假手术组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.01；与水沟低频组比较，△P＜0.01。

组别nP65阳性细胞表达量空白组617.33±2.74假手术组613.53±3.08模型组665.97±3.38*水沟低频组648.93±4.85#水沟中频组643.10±6.16#水沟高频组637.87±3.65#△

2.3免疫组化检测大脑皮质Caspase-3的阳性表达实验结果显示，模型组与空白组、假手术组比较（P＜0.01）有统计学差异，模型组大鼠大脑皮质细胞Caspase-3的阳性表达量明显多于空白组和假手术组；各针刺组与模型组比较（P＜0.01）有统计学差异，针刺组治疗后大鼠大脑皮质的细胞凋亡数量比模型组大鼠明显减少；水沟低频组和高频组有统计学差异（P＜0.01），水沟中频组和高频组比较无统计学差异（P＞0.05）。见表3。

表3　各组大鼠皮质细胞Caspase-3的阳性表达比较Tab.3　Comparison of positive expression of Caspase-3 cerebral cortex of rats in each group

表3　各组大鼠皮质细胞Caspase-3的阳性表达比较Tab.3　Comparison of positive expression of Caspase-3 cerebral cortex of rats in each group

注：与空白组及假手术组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.01；与水沟低频组比较，△P＜0.01。

组别nCaspase-3阳性细胞表达量空白组611.97±4.84假手术组616.00±4.40模型组668.27±3.79*水沟低频组644.57±5.52#水沟中频组640.23±3.13#水沟高频组638.13±2.21#△

3　讨论

脑缺血再灌注损伤是指脑缺血一定时间再恢复血液供应后，大脑功能不仅没有得到及时恢复，反而出现更加严重的功能活动障碍。缺血再灌注损伤是一种常见、复杂的病理生理过程，其主要的损伤形式是细胞凋亡。NF-κB参与多种趋化因子、炎性细胞因子和成纤维细胞因子的合成，是介导细胞增殖分化、炎症反应和诱导细胞凋亡的关键性转录因子。NF-κB与脑缺血再灌注损伤关系密切［4-6］，NF-κB调控着脑缺血再灌注损伤中一些黏附分子和细胞因子的表达，主要由p50和p65两个亚基组成。

Caspase家族是一大类凋亡调控因子，Caspase-3 是Caspase级联“瀑布下游”最关键的凋亡执行蛋白酶，其在正常细胞（包括神经细胞）中以酶原形式存在，受凋亡刺激因素作用后激活，参与脑缺血再灌注后神经元损伤的病理过程，引起细胞凋亡。研究证明Caspase-3在各种因素启动的凋亡程序中起最后枢纽作用［7］，是细胞凋亡的重要执行者和哺乳动物细胞凋亡的关键蛋白酶，被称作是“杀手蛋白”。近年来国内外很多学者［2，8］都通过实验证实：大鼠脑缺血再灌注后Caspase-3表达明显增强，凋亡细胞明显增加，两者之间存在明显的时空相关性。

醒脑开窍针刺法治疗中风病疗效显著［9-10］，水沟穴是“醒脑开窍”针刺法的主穴，系督脉穴，为手、足阳明经与督脉的交会穴，可调督脉、开窍启闭，醒脑开窍宁神。许多研究表明［11-13］，针刺水沟穴可改善脑循环，可促进侧支循环建立，抑制脑神经细胞凋亡。提插是行针的基本手法之一，提插的频率是针刺手法量学中的重要内容，提插的快慢的不同会导致针刺的效果不同。《灵枢·九针十二原》又云:“刺之害，中而不去则精泻，不中而去则致气。”均指明针的刺激量之有余和不足，不仅影响疗效，而且会给患者带来不良后果［14］。手法量学的研究就显得尤为重要。本课题组以往的针刺水沟穴的针刺时间因素研究中，显示对水沟施以5、60、180 s针刺时间，均有明显改善大脑中动脉缺血模型大鼠行为学的趋势，且优于非穴组，显示了水沟穴效应的特异性［15］。

本实验结果显示，皮质细胞凋亡阳性细胞比较，模型组与空白组和假手术组比较有显著统计学意义，说明脑缺血再灌注后，模型组出现大量细胞凋亡。各针刺组与模型组比较有显著统计学意义，针刺组治疗后大鼠大脑皮质的细胞凋亡数量比模型组大鼠明显减少，说明针刺治疗效果明显，水沟低频组和水沟中频组及高频组均有统计学差异，水沟中频组和高频组比较无显著性差异，说明水沟中频组和高频组效果优于针刺低频组。免疫荧光检测大脑皮质Caspase-3和NF-κB p65的阳性表达，模型组与空白组和假手术组比较有显著统计学意义，说明脑缺血再灌注后，模型组大脑皮质Caspase-3 和NF-κB p65阳性表达含量较正常组大幅度升高；各针刺组与模型组比较有显著统计学差异，针刺组治疗后大鼠大脑皮质的Caspase-3和NF-κB p65阳性表达量比模型组大鼠明显减少。水沟低频组和高频组有统计学差异，水沟中频组和高频组比较无显著性差异，说明水沟中频组和水沟高频组效果优于针刺低频组。

根据以上结果可以初步分析，在脑缺血再灌注发生后，某些物质可能激活了NF-κB p65，诱导NF-κB p65参与炎症反应和神经元凋亡途径，进而激活相关信号通路，最终导致Caspase-3阳性表达增高，引起神经元损伤，而针刺可能通过对上述过程某些中间产物的调控，下调NF-κB p65及Caspase-3阳性表达，发挥抗脑缺血损伤的作用。针刺各个频率组都可显著降低脑缺血再灌注损伤所致的细胞凋亡，其中水沟中频组和高频组要显著优于低频组，其可能与降低大脑皮质细胞NF-κB p65和Caspase-3的表达量有关，中频组和高频组的比较优势还有待后续实验进一步证实。

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（本文编辑：马英，马晓辉）

Effect of acupuncture on GV26 with lift-thrusting manipulation of different frequencies specifically regulating the expression of cortical cell apoptosis，NF-κB p65 and Caspase-3

SHEN Yan，WANG Yong，LI Zhuo，LIN Haiping，CHEN Ying-ying，WANG Shu
（Acupuncture Research Institute of The First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Key Laboratory of Encephalopathy Acupuncture，The Third Level Laboratory of Acupuncture Dose-effect relationship of State Administration of Traditional Chinese Medicine，Key Laboratory of Acupuncture and Moxibustion，Tianjin 300193，China）

［Objective］To observe effect of different acupuncture frequencies on NF-κB p65 and Caspase-3 of cerebral cortex region in Focal cerebral ischemia-reperfusion rats，so as to explore the appropriate frequency.［Methods］The 36 male Wistar rats were randomized into 6 groups:control group，false surgery group，model group，Shuigou（GV 26）with low frequency lifting-inserting manipulation（GV26-LOW）group，GV 26 with mid frequency lifting-inserting manipulation（GV26-MID）group and GV 26 with high frequency lifting-inserting manipulation（GV26-HIGH）group.The control group was not subjected to modeling，the false surgery group was operated as modeling groups but without procedure of inserting thread embolism into internal carotid artery，comparatively，the other four modeling groups were all completed the focal cerebral ischemia-reperfusion procedures.Rats in control group，false surgery group and model group were fedroutinely without acupuncture treatment；while，rats in GV26-LOW group，GV26-MID group，and GV26-HIGH group were all acupunctured on GV26 with corresponding methods twice a day for three days.Expression of cortical cell apoptosis was detected by TUNEL method and expression of NF-κB p65 and Caspase-3 in cerebral cortex by immunohistochemistry.［Results］Expression of cortical cell apoptosis in 3 acupuncture groups were significantly lower than that in model group（P＜0.01），moreover，its expression in GV26-MID group and GV26-HIGH group were significantly lower than that in GV26-LOW group（P＜0.01 or P＜0.05）.While，there was no statistical difference in cortical cell apoptosis expression between GV26-HIGH group and GV26-MID group（P＞0.05）.Expression of cortical NF-κB p65 and Caspase-3 in 3 acupuncture groups were significantly lower than that in model group（P＜0.01），moreover，its expression GV26-HIGH group were significantly lower than that in GV26-LOW group（P＜0.01）.While，there was no statistical difference in cortical NF-κB p65 and Caspase-3 between GV26-HIGH group and GV26-MID group（P＞0.05）.［Conclusion］Acupuncture with 3 different manipulation frequencies could significantly reduce the apoptosis caused by cerebral ischemia-reperfusion，while acupuncture with mid frequency and high frequency is superior to acupuncture with low frequency in the management of cerebral ischemia-reperfusion damage，which may be regulated by expression of NF-κB p65 and Caspase-3 in cerebral cortex.

acupuncture；acupoint；Shuigou；focal cerebral ischemia-reperfusion；stimulus parameter/acupuncture effect

R338.25

A

1672-1519（2015）03-0160-05

国家自然科学基金资助项目（81173339）；天津市应用基础及前沿技术研究计划重点项目（11JCZDJC19800）；长江学者和创新团队发展计划。

沈燕（1978-），女，主治医师，主要研究方向为针刺治疗脑血管病及偏头痛的临床及基础研究。

王舒，E-mail:wangs2008@163.com。

（2014-10-20）