莱菔承气汤对重症急性胰腺炎大鼠肾脏细胞凋亡的影响*

2015-08-26宋宝骥付金鹏李家瑞天津市天津医院普通外科天津300天津市天津医院急诊医学科天津300

天津中医药 2015年5期

宋宝骥，付金鹏，李家瑞（.天津市天津医院普通外科，天津300；.天津市天津医院急诊医学科，天津300）

宋宝骥1，付金鹏1，李家瑞2
（1.天津市天津医院普通外科，天津300211；2.天津市天津医院急诊医学科，天津300211）

［目的］探讨中药莱菔承气汤对重症急性胰腺炎（SAP）大鼠肾脏细胞凋亡及凋亡基因Bax和Bcl-2表达的影响。［方法］健康Wistar大鼠72只，随机分为空白对照组（24只）、SAP模型组（24只）和莱菔承气汤治疗组（24只）。3组大鼠均于术后6 h，12 h，24 h心脏采血，检测血肌酐（Cr）、血尿素氮（BUN）。Annexin V-FITC/PI双染后流式细胞术检测肾脏细胞凋亡指数，RT-PCR检测肾脏组织Bax、Bcl-2 mRNA的表达。［结果］与对照组相比较，随着时间变化，SAP模型组大鼠血肌酐、血尿素氮水平明显升高（P＜0.01），肾脏细胞凋亡指数趋于升高，Bax mRNA表达明显升高（P＜0.01），Bcl-2 mRNA表达明显下降（P＜0.01）。与SAP模型组相比较，莱菔承气汤治疗组大鼠血肌酐、血尿素氮水平明显下降（P＜0.01），肾脏细胞凋亡指数下降，Bax mRNA表达明显下降（P＜0.01），Bcl-2 mRNA表达明显升高（P＜0.01）。［结论］中药莱菔承气汤可能通过调节凋亡相关基因，减少肾脏细胞凋亡以减轻肾脏病理损伤，从而改善SAP时并发的急性肾功能障碍。

重症急性胰腺炎；莱菔承气汤；细胞凋亡；Bax；Bcl-2

重症急性胰腺炎（SAP）是一种外科常见危急重症，发病急，进展快，常在短时间内出现多脏器功能障碍，肾脏受累仅次于肺。肾脏功能障碍一旦进展为急性肾功能衰竭，患者病死率明显升高［1］。既往研究表明，应用中药莱菔承气汤治疗重症胰腺炎可明显减轻肾脏病理损害［2］，但其作用机制尚未阐明。本文通过建立SAP模型，探讨莱菔承气汤对SAP大鼠肾脏细胞凋亡及凋亡基因的影响，从而为临床治疗SAP提供新的实验依据和理论基础。

1　材料和方法

1.1材料莱菔承气汤购于天津医科大学总医院中药房，方剂组成：大黄20 g（后下），芒硝15 g，厚朴15 g，枳壳10 g，莱菔子15 g，木香10 g，牛膝10 g，加水煎制成200 mL药液；牛磺胆酸钠由北京奥博星生物技术责任有限公司提供；健康Wistar大鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司；IV型胶原酶由Gibco公司提供；引物设计和合成由上海生工生物工程技术服务有限公司提供；Trizol购于美国Invitrogen公司；RT-PCR试剂盒由美国Fermentas公司提供。

1.2方法

1.2.1动物和模型健康Wistar大鼠72只，体质量230～300 g，雌雄各半，将大鼠随机分为空白对照组（24只）、SAP模型组（24只）和莱菔承气汤治疗组（24只）。采用5%牛黄胆酸钠胆胰管内逆行注入的方法诱导SAP大鼠模型［2］。对照组开腹后翻动胰腺数次；SAP模型组和莱菔承气汤治疗组，使用连接微量注射泵的一次性静脉留置套管针于胆胰管开口处的十二指肠对系膜缘的肠壁穿刺，将套管经胆胰管开口处逆行插入胆胰管约1.0 cm，以0.1 mL/min的速度匀速注入5%牛磺胆酸钠（1 mL/kg）。注毕5 min后拔管，回纳十二指肠后关腹。莱菔承气汤治疗组按3 mL中药/100 g大鼠体质量，于造模后2 h灌胃；空白对照组和SAP模型组于造模后2 h给予等量生理盐水灌胃。

1.2.2标本采集和保存3组大鼠均于术后6h，12h，24 h麻醉后心脏采血，室温放置待自然凝固后，离心获得血清，冻存于-20℃备测血肌酐（Cr）、血尿素氮（BUN）。取血后剖腹，切取双肾组织，左肾用于肾脏细胞凋亡检测，右肾用于总RNA及蛋白提取。

1.2.3血清Cr、BUN测定由自动生化分析仪检测。

1.2.4肾脏细胞凋亡检测采用胶原酶消化法分离大鼠肾脏细胞［3］。取肾后将肾组织剪成碎块，然后加入足量的胶原酶消化液，37℃水浴振荡，充分消化5 min，用吸管反复吹打，吸取上清液，存于4℃冰箱内。剩余组织块继续加入胶原酶消化液，重复上述步骤，直至组织碎块完全消化。将所有上清液在4℃、800 r/min离心5 min得沉淀。向沉淀中加入细胞培养液，经200目不锈钢筛网过滤，再以500 r/min离心2 min，弃上清液，所得沉淀即为大鼠肾细胞。按照AnnexinV-FITC/PI双染试剂盒说明，用4℃PBS洗涤细胞两次，用结合缓冲液调节细胞浓度为5×105/ mL～10×105/mL，取95 μL细胞悬液置于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V/FITC和10 μL 20 μg/mL的碘化丙锭溶液，充分混匀，在室温避光条件下孵育15min，然后在反应管中加入400 μL PBS，应用流式细胞仪检测。

1.2.6RT-PCR检测肾脏组织中Bax、Bcl-2 mRNA的表达Trizol一步法提取肾脏组织总RNA，并逆转为cDNA（日本宝生物试剂盒），荧光定量PCR反应条件（美国Bio-Rad公司荧光定量PCR仪）：95℃5min，95℃45s，57℃45s，72℃60s，35个循环；末循环72℃10min。大鼠Bax和Bcl-2引物序列如下：Bax：上游：5’-CCG CTG TGC ACC GGG ACA TG-3’，下游：5’-CTC GCG GTG AAG GGC GTC AG-3’，扩增产物长度：196 bp。Bcl-2：上游：5’-GGC ATC TTC TCC TTC CAG-3’，下游：5’-ATC CCA GCC TCC GTT AT-3’，扩增产物长度：441 bp。β-actin：上游：5’-TGACG GGGTC ACCCA CACTG TGCCC ATCTA-3’，下游：5’-CTAGA AGCAT TGCGG TGGAC GATGG AGGG-3’，扩增产物长度：666 bp。

1.3统计学处理方法实验数据应用SPSS18.0统计软件进行分析。计量资料资料经分析均呈正态分布，以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较时，若方差齐采用LSD法，若方差不齐采用Dunnett’s T3法，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2　结果

2.13组大鼠血Cr变化与对照组相比，SAP模型组血Cr明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。与SAP模型组相比，莱菔承气汤治疗组血Cr明显降低，差异统计学意义（P＜0.01）。3组大鼠血Cr水平见表1。

2.23组大鼠血BUN变化与对照组相比，SAP模型组血BUN明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。与SAP模型组相比，莱菔承气汤治疗组血BUN明显降低，差异统计学意义（P＜0.01）。3组大鼠血BUN水平见表2。

表1　3组大鼠血Cr水平（±s）Tab.1　The Cr level of blood in three groups（±s）μmol/L

注：*P＜0.01，*与对照组相比较，#与SAP模型组相比较。

分别12 h24 h对照组036.40±03.04037.79±04.52 SAP模型组188.59±12.76a264.03±16.97*莱菔承气汤治疗组102.12±10.85b151.64±11.66#F值26.928*30.856* n 24 24 24 24 6 h 038.49±04.28 110.71±13.63a086.09±9.37b12.572*

表2　3组大鼠血BUN水平（±s）Tab.2　The BUN level of blood in three groups（±s）μmol/L

注：*P＜0.01，*与对照组相比较，#与SAP模型组相比较。

组别12 h24 h对照组08.40±2.048.79±1.52 SAP模型组24.59±3.76a30.03±4.97*莱菔承气汤治疗组15.12±2.85b18.64±3.66#F值18.318*22.952* n 24 24 24 24 6 h 08.49±2.28 18.71±3.63a12.09±2.37b10.142*

2.33组大鼠肾脏细胞凋亡检测与对照组相比，SAP模型组肾脏细胞凋亡指数明显升高，差别有统计学意义（P＜0.01）。与SAP模型组相比，莱菔承气汤治疗组肾脏细胞凋亡指数明显降低，差别统计学意义（P＜0.01）。3组大鼠肾脏细胞凋亡指数水平见表3。

表3　3组大鼠肾脏细胞凋亡指数水平（±s）Tab.3　The kidney cell apoptosis index in three groups（±s）%

注：*P＜0.01，a与对照组相比较，b与SAP模型组相比较。

组别12 h24 h对照组1.02±0.261.08±0.24 SAP模型组16.17±2.68a21.03±3.36a莱菔承气汤治疗组10.82±1.54b14.62±2.32bF值19.322*23.258* n 24 24 24 24 6 h 0.98±0.28 10.26±1.36a6.84±1.04b14.116*

2.43组大鼠肾脏组织（Bax mRNA）的表达与对照组相比，SAP模型组肾脏组织Bax mRNA表达明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。与SAP模型组相比，莱菔承气汤治疗组肾脏组织Bax mRNA表达明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。3组大鼠肾脏组织Bax mRNA的表达变化见表4。

2.53组大鼠肾脏组织（Bcl-2 mRNA）的表达与对照组相比，SAP模型组肾脏组织Bcl-2 mRNA表达明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。与SAP模型组相比，莱菔承气汤治疗组肾脏组织Bcl-2mRNA表达明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。3组大鼠肾脏组织Bcl-2mRNA的表达变化，见表5。

表4　肾脏组织Bax mRNA的表达变化（±s）Tab.4　The expression of Bax mRNA in kidney tissue（±s）h

注：*P＜0.01，a与对照组相比较，b与SAP模型组相比较。

组别12 h24 h对照组0.67±0.060.66±0.04 SAP模型组2.83±0.49a3.70±0.57a莱菔承气汤治疗组1.52±0.36b1.96±0.42bF值16.276*20.662* n 24 24 24 24 6 h 0.65±0.05 1.98±0.32a0.94±0.28b11.474*

表5　肾脏组织Bcl-2 mRNA的表达变化（±s）Tab.5　The expression of Bcl-2 mRNA in kidney tissue（±s）h

注：*P＜0.01，a与对照组相比较，b与SAP模型组相比较。

组别1224对照组1.92±0.351.98±0.39 SAP模型组0.64±0.18a0.58±0.12a莱菔承气汤治疗组1.28±0.16b1.44±0.18bF值14.578*18.766* n 6 24 24 24 24 1.94±0.42 0.72±0.21a1.12±0.15b10.124*

3　讨论

近年来，应用中西医结合早期治疗SAP取得了良好的临床效果，SAP晚期的并发症和病死率显著下降。SAP初期以非感染性（MODS）为主要表现，中医辩证多为少阳阳明合证或阳明腹实证，严重患者可表现为结胸里实证。中医药治疗以通里攻下为主。莱菔承气汤是中医下法中的代表方剂，早期应用可消除腹胀，早期恢复肠蠕动，减少肠源性内毒素吸收及肠道细菌移位，防止胰腺及胰周坏死组织感染，可使病人不经过进展期直接由初期进入恢复期，减少并发症的发生，降低病死率［4］。动物实验也表明，莱菔承气汤可降低SAP大鼠血清白细胞介素-1（IL-1）、肿瘤坏死因子（TNF）等细胞因子浓度，同时减轻SAP时合并的多个脏器病理损害［2］。

重症急性胰腺炎常合并有急性肺损伤和急性肾功能障碍，后者进一步发展为急性肾衰竭，导致患者病死率大幅上升［5］。SAP合并肾损伤是一个多因素参与的复杂的病理生理过程。既往实验研究表明，细胞凋亡参与了SAP时急性肾损伤的发生发展过程。奉镭等［6］研究发现，SAP大鼠肾小管上皮细胞凋亡指数明显升高。抑制肾小管上皮细胞凋亡，对大鼠缺血-再灌注所致的肾损伤有保护性的作用［7］；诱导肾小管上皮细胞凋亡，可进一步加重本身存在的肾损伤［8］。Takase等［9］研究发现，SAP小鼠造模后6 h，并发急性肾功能衰竭的小鼠肾脏细胞出现凋亡。庄永敬等［10］研究也表明，SAP时大鼠肾脏细胞凋亡数明显增加，凋亡指数增高，凋亡发生的部位病理改变明显，凋亡指数与肾功能损害呈正相关关系。本实验研究也证实，随着时间变化，SAP模型组大鼠血Cr、BUN明显升高，表明SAP大鼠同时合并有急性肾功能障碍。同时也发现，与对照组相比，SAP模型组大鼠肾脏细胞凋亡指数明显升高。与SAP模型组相比较，莱菔承气汤治疗组大鼠血Cr、BUN明显下降，肾脏细胞凋亡指数明显降低。

细胞凋亡是受众多凋亡相关基因控制的程序性细胞死亡。Bax是线粒体途径重要的促凋亡因子，Bax可形成Bax/Bax同源二聚体，诱导细胞凋亡；Bcl-2亚家族对细胞凋亡起抑制作用，其中Bcl-2控制着凋亡的一些共同通路。Bcl-2可竞争性地与Bax结合，形成更稳定的Bax/Bcl-2异源二聚体，“中和”Bax/Bax诱导凋亡的作用，从而减少细胞凋亡。下调Bax的表达和上调Bcl-2的表达可抑制细胞凋亡［11］。本实验研究发现，与对照组相比较，SAP模型组大鼠肾脏Bax mRNA表达明显升高，Bcl-2 mRNA表达明显降低。与SAP模型组相比较，莱菔承气汤治疗组大鼠肾脏Bax mRNA表达明显下降，Bcl-2mRNA表达明显升高。

以上提示，SAP时，肾脏细胞凋亡增加可能是并发急性肾功能障碍的原因之一，肾脏细胞凋亡的增加可能与Bax的过表达和Bcl-2的低表达有关。中药莱菔承气汤可能通过下调Bax mRNA的表达和上调Bcl-2mRNA的表达，减少肾脏细胞凋亡以减轻肾脏病理损伤，从而改善SAP时并发的急性肾功能障碍。当然，这仍需要更多的相关实验研究进一步证实。

［1］Lin HY，Lai JI，Lai YC，et al.Acute renal failure in severe pancreatitis:A population-based study［J］.Ups J Med Sci，2011，116（2）:155-159.

［2］付金鹏，尤胜义.IL-18与SAP免疫和脏器损害及中药调控作用的研究［D］.天津医科大学，2008.

［3］Mückter H，Islambouli S，Doklea E，et al.Isolated rat kidney tubules as a screening system for arsenic antidotes［J］.Toxicol Appl Pharmacol，1993，121（1）:118-128.

［4］吴咸中.腹部外科实践［M］.天津：天津科学技术出版社，2004：1257.

［5］Pupelis G.Renal failure in acute pancreatitis.Timing of dialysis and surgery［J］.Przeql Lek，2000，57（Suppl 5）:29-31.

［6］奉镭，穆小松，刘翼，等.川芎嗪对重症胰腺炎大鼠肾细胞凋亡的影响［J］.中国中医急症，2013，22（1）：36-39.

［7］Gong L，Yu H，ZhuGe Y，et al.Neutrophil gelatinase-associated lipocalinprotectsrenaltubularepithelialcellinischemic/ reperfusion injury rats via apoptosis-regulating proteins［J］.Ren Fail，2012，34（6）：777-783.

［8］Balasubramanian S，Jansen M，Valerius MT，et al.Orphan nuclear receptor Nur77 promotes acute kidney injury and renal epithelial apoptosis［J］.J Am Soc Nephrol，2012，23（4）：674-686.

［9］Takase K，Takeyama Y，Nishikawa.Apoptotic cell death of renal tubules in experimental severe acute pancreatitis［J］.Surgery，1999， 125（4）：411-420.

［10］庄永敬，于永扬，吴贵荣.乌司他丁对重症急性胰腺炎大鼠肾脏细胞凋亡及bcl-2基因表达的影响［J］.中国普外基础与临床杂志，2007，41（6）：656-659.

［11］He Y，Wan H，Du Y，et al.Protective effect of Danhong injection on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats［J］.J Ethnopharmacol，2012，144（2）：387-394.

（本文编辑：马英，张震之）

Effect of Laifu Chengqi decoction on the apoptosis of renal cells in rats with severe acute pancreatitis

SONG Bao-ji1，FU Jin-peng1，LI Jia-rui2
（1.Department of General Surgery，Tianjin Hospital，Tianjin 300211，China；2.Department of Emergency Medicine，Tianjin Hospital，Tianjin 300211，China）

［Objective］To investigate the effect of Laifu Chengqi decoction on the apoptosis of renal cells and expression of apoptosis gene Bax and Bcl-2 in rats with severe acute pancreatitis.［Methods］The 72 healthy Wistar rats were randomly divided into control group（24 rats），SAP group（24 rats）and Laifu Chengqi decoction group（24 rats）.Heart blood of rats in the three groups was taken at 6 h，12 h，24 h after operation to detect serum Cr and BUN.Renal cells stained by Annexin V-FITC/PI were drawn off from kidney to detect apoptosis rate using flow cytometer.The expression of Bax and Bcl-2 mRNA in pancreatic tissue were detected by RT-PCR.［Results］Compared with the control group，with the change of time，serum Cr and BUN in SAP group were increased significantly（P＜0.01）.Index of renal cell apoptosis was increased gradually.The expression of Bax mRNA was significantly increased（P＜0.01）.The expression of Bcl-2 mRNA was significantly decreased（P＜0.01）.Compared with the SAP group，serum Cr and BUN in Laifu Chengqi decoction group were decreased（P＜0.01），and index of renal cell apoptosis was decreased.The expression of Bax mRNA was significantly decreased（P＜0.01），the expression of Bcl-2 mRNA was significantly increased（P＜0.01）.［Conclusion］Laifu Chengqi decoction may regulate the apoptosis related gene to decrease the apoptosis of renal cells，thereby reducing renal pathological damage.

severe acute pancreatitis；Laifu Chengqi decoction；cell apoptosis；Bax；Bcl-2

R285.5

1672-1519（2015）05-0295-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.05.11

天津市医药卫生重点学科攻关项目（10kG118）；天津卫生局科研课题基金项目。

宋宝骥（1978-），男，主治医师，主要从事普通外科临床和实验工作。

（2014-12-05）