金天格胶囊对大鼠长骨干骨折愈合影响的实验研究*

张蔚然，陆　军，宋东辉，曾宪帆，王　威，杨　杰（1.天津市公安医院骨科，天津300042；2.天津市公安医院足踝外科研究所，天津300042）

金天格胶囊对大鼠长骨干骨折愈合影响的实验研究*

张蔚然1，2，陆军1，2，宋东辉1，2，曾宪帆1，2，王威1，2，杨杰1，2
（1.天津市公安医院骨科，天津300042；2.天津市公安医院足踝外科研究所，天津300042）

［目的］研究金天格胶囊对大鼠股骨干骨折愈合的影响，以及应用Micro-CT技术对骨折愈合过程中骨内微结构的观察。［方法］将40只8周龄SD雄性大鼠通过随机数字表法分为两组，分别为实验组和对照组，每组20只。分别建立股骨干闭合骨折髓内钉固定模型，术后第3天始给予相应的干预措施。每组于造模后2周及8周两个时间点各处死实验动物10只。对患肢股骨进行取材后，大体观察骨折愈合情况，通过X线对骨折愈合情况进行评分，利用生物力学实验机测量骨痂的最大载荷、最大载荷恢复率，利用Micro-CT技术计算骨痂的总体积（TV）、骨体积（BV）及骨体积分数（BV/TV%）并对骨痂进行组织形态学观察。［结果］术后2周，实验组和对照组骨折愈合X线评分没有统计学差异。Micro-CT检测结果提示，实验组的TV值高于对照组，但两者的BV及BV/TV%值没有统计学差异。两组骨痂的最大载荷和最大载荷恢复率差异无统计学意义。术后8周，两组的X线评分、TV值没有统计学差异。但实验组的最大载荷、最大载荷恢复率、BV值及BV/TV%值高于对照组，差异有统计学意义。［结论］金天格胶囊可以促进骨折愈合。主要表现在骨折早期它会促进软骨痂的形成，骨折后期加速骨痂的矿化，提高骨折愈合的力学性能。

中药；骨折；动物模型；Micro-CT；治疗

骨折是指骨的连续性以及完整性被破坏，是骨机械性能超负荷的结果。骨折愈合是一个十分复杂的生物学修复过程。因各种原因导致的骨折延迟愈合和不愈合不仅会增加患者的痛苦还会增加患者的经济负担，多数患者还会留有功能障碍。因此，如何促进骨折愈合，缩短骨折愈合时间，减少患者并发症的发生，是广大创伤骨科医生非常关心的问题之一［1-3］。中医治疗骨折有着悠久的历史，且中药治疗骨折既经济且疗效确切，体现了中药治疗骨折的优势［4-10］。本研究通过建立大鼠长骨干骨折模型，观察联合金天格胶囊及髓内钉治疗对骨折愈合的影响。

1　材料与方法

1.1实验动物8周龄雄性SD大鼠40只（SPF级，天津医科大学动物实验中心提供），体质量225～251 g，采用随机数字表法将其分为两组，每组20只，分别为实验组和对照组。饲养于天津医科大学标准动物实验中心，标准鼠粮适应性饲养1周，自由饮水，室温（21±3）℃，间隔12 h照明，定期消毒及通风。实验符合实动物道德标准，获得天津市公安医院伦理委员会批准。

1.2药物金天格胶囊（由金花集团股份有限公司现金花制药厂提供，国药准字Z20030080号，产品批号140319，规格为每粒0.4 g）的复方药物由人工虎骨粉组成。将中药颗粒溶于20倍蒸馏水中，放置于加热搅拌台上进行充分溶解并浓缩，制成药物混悬液。

1.3实验器材5 mL一次性使用无菌注射器针头（直径为1 mm，碧迪医疗器械有限公司提供）；金属骨针（长150 mm，直径0.8 mm，天津市新中医疗器械有限公司提供）。数字放射成像机（DR）；Endura TEC ELF 3300力学实验仪器（Bose公司，美国）；Micro-CT成像系统（1172V2型，SKYSCAN公司，比利时）；Leica SM2000R型平推切片机；光学显微镜及拍照系统。

1.4实验方法

1.4.1骨折模型制作方法使用3.5%的水合氯醛（10 mL/g）行腹腔麻醉成功后，常规消毒，取左下肢髌骨外侧缘纵行切口，长约1 cm，逐层切开皮肤及部分股四头肌腱性组织，屈曲膝关节并向内侧脱位髌骨，清楚显露股骨髁间凹。利用一根5 mL注射器针头（直径1 mm）在股骨髁间凹处开口，逆行插入克氏针沿髓腔至股骨粗隆间。剪断多余的克氏针，并将其远端埋于股骨髁间骨皮质下。碘伏及生理盐水反复冲洗切口后，使用3-0丝线逐层缝合切口。将动物左下肢外展内旋位固定于造模支架上，通过三点弯曲实验的原理打击大腿中部，致股骨中断横行骨折。

1.4.2术后处理术后立即在麻醉状态下拍摄患肢正侧位X线片，了解骨折类型及移位程度，要求骨折类型为股骨中段横行骨折或短斜形骨折，骨折端固定理想无明显移位，内固定位置理想。造模不合格的大鼠予以剔除，并及时补充样本量。大鼠单笼饲养，周期定时添足饲料，饮水不加限制，每1～2天更换1次垫料，保持干燥。

1.4.3给药方法造模成功后第4天始进行相应的药物治疗。通过灌胃方式给药，给药剂量经人-大鼠体表面积比值折算成等效剂量［公式为成人每天总量3.6 g×0.07/1.5=0.168 g/（kg·d）］，用蒸馏水配置成相应浓度的药物混悬液。每只大鼠的给药容积为1mL，对照组给予等量的蒸馏水，每天1次，持续至标本取材。

1.5观察项目与方法

1.5.1标本取材于术后第2、8周两个时间点，两组各取10只大鼠，过量麻醉处死，取手术侧及健侧股骨全长标本，剔除附着股骨干的肌肉，取出髓内钉后用湿盐水纱布包裹置-20℃冰箱中低温保存。

1.5.2骨痂大体标本观察取材后肉眼观察两组大鼠骨折侧股骨的骨痂外形，比较两组大鼠骨痂形成的情况以及骨折端的稳定程度。

1.5.3X线评分大鼠过量麻醉后立即行股骨全长X线照片，观察骨折两端的变化。使用X线机拍摄股骨正位X线片，摄片条件为：电压40 KV，电流2 mAs，曝光时间4 ms。由两名研究者独立使用Goldberg法［11］对骨折愈合进行评分：0=影像学未愈合；1=部分愈合；2=完全愈合。如遇结果不一致，通过请教第三方解决。

1.5.4Micro-CT检查将样本置于Micro-CT测试管内，沿标本长轴方向进行扫描，获取连续的Micro-CT图像，层间距为26.6 μm，平面图像分辨率为1024×1024，像素点尺寸为20 μm×20 μm，放射剂量为49 KV，795 uA。图像高斯虑波后，以骨折部位为中心进行三维重建。利用CTAn分析软件（SKYSCAN公司，比利时）将得到的三维图像信息进行分析，将图像灰度值81定为骨组织与非骨组织的分界线。定义骨折部位上下5 mm范围内的区域为兴趣区（Range of interest，ROI）。通过ROI的建立，计算样本骨痂的总体积（total callus volume，TV， mm3），骨体积（total bone volume，BV，mm3），骨体积分数（BV/TV，%）。

1.5.5力学测试测试前室温解冻标本，使用Endura TEC ELF 3200力学实验仪器进行四点弯曲试验。顶端跨距为8 mm，底端跨距为20 mm。加载速度为1 mm/min。测量时保持各标本位置一致，并保持标本湿润状态。记录载荷-位移曲线、最大载荷、最大载荷恢复率。

1.5.6组织学观察取骨折断端局部组织置于4%多聚甲醛溶液中，4℃下固定48 h。然后，将标本置于硝酸—甲醛脱钙液中进行脱钙，直至组织软化为止。脱钙后用酒精梯度脱水，使用二甲苯透明处理2 h，石蜡包埋。沿股骨干长轴切片，厚度为5 μm，再行HE染色。随机取5张股骨切片，分别在光学显微镜下观察骨折的生长情况。

2　结果

2.1骨痂大体标本观察术后2周，实验组与对照组的骨折断端均可见肥大的骨痂形成。骨折端愈合尚稳定，部分标本骨折断端稍有微动。术后第8周时，两组标本骨折端骨痂体积均较前变小，骨折愈合稳定，骨折断端均未见明显活动。

2.2X线评分2周时，实验组的X线评分（1.00± 0.57）分与对照组组的X线评分（0.91±0.58）比较差异无统计学意义（t=0.35，P=0.73）。8周时，实验组的X线评分（1.95±0.30）分与对照组组的X线评分（1.95±0.41）分比较差异也无统计学意义（t=0.61，P= 0.66），见图1、2。

图1　术后2周大鼠股骨X线检查结果Fig.1　The results of X-ray at 2 weeks after fracture

2.3Micro-CT检查结果术后第2周实验组的ROI区域的平均总体积（669.05±27.50）mm3大于对照组（639.55±25.30）mm3，组间差异有统计学意义（t=2.81，P=0.02）。而两者的平均骨体积分别为（50.68±4.53）mm3和（49.38±4.86）mm3，组间无统计学差异（t=0.51，P=0.72）。平均骨体积分数分别为8.21%± 0.51%和8.73%±0.66%，两组比较无统计学差异（t=1.25，P=0.39）。而术后8周时，实验组与对照组ROI区域的平均总体积分别为（378.50±30.08）mm3和（388.64±37.90）mm3，两者没有统计学差异（t=0.33，P=0.75）。但平均骨体积，实验组大于对照组，分别为（85.27±4.99）mm3和（71.31±4.86）mm3，两者差异具有统计学意义（t=2.70，P=0.01）。实验组的平均骨体积分数（25.20%±0.74%）大于对照组（16.41%±0.91%），且组间差异有统计学意义（t=4.42，P＜0.01），见图3、4、5。

图2　术后8周大鼠股骨X线检查结果Fig.2　The results of X-ray at 8 weeks after fracture

图3　术后2周大鼠股骨Micro-CT检查结果Fig.3　The results of Micro-CT at 2 weeks after fracture

图4　术后8周大鼠股骨Micro-CT检查结果Fig.4　The results of Micro-CT at 8 weeks after fracture

图5　术后2、8周大鼠骨痂BV/TV%值的柱状图Fig.5　The results of BV/TV%of callus at 2 and 8 weeks after fracture

2.4力学测试结果通过载荷—位移曲线获得最大载荷。两组模型骨折后的最大载荷随时间的延长逐渐增加。术后2周时，实验组的最大载荷（27.32± 1.10）N与对照组（26.54±0.97）比较没有统计学差异（t=1.10，P=0.33）。而术后8周时，实验组的最大载荷（59.96±2.95）N大于对照组（35.23±1.22）N，且差异有统计学意义（t=2.49，P=0.04）。以骨折侧股骨最大载荷占对侧非骨折侧股骨最大载荷比例表示骨折载荷恢复率。结果显示，术后2周时两组的最大载荷恢复率比较没有统计学差异，而术后8周时实验组的最大载荷恢复率高于对照组，且差异有统计学意义，见图6、7。

图6　术后2、8周大鼠股骨抗弯最大载荷力学结果柱状图Fig.6　The results of bending maximal load of femur at 2 and 8 weeks after fracture

2.5组织学观察术后2周时，实验组的骨折端有较多的纤维性和软骨性骨痂，并在软骨痂边缘见到钙化，可见骨外膜下成骨。同时，大量骨小梁开始形成，骨小梁间隙内可见丰富的毛细血管。对照组的骨折端亦有较多纤维骨痂和软骨痂形成，但间隙较大，结构疏松。术后8周时，实验组见部分软骨骨痂被骨性骨痂替代，部分成熟的骨小梁，矿化更加明显，小梁与应力方向一致，排列有序。对照组骨小梁方向性不明显，成骨不够活跃，骨小梁增粗不及实验组明显，见图8。

图7　术后2、8周大鼠股骨抗弯最大载荷恢复率结果柱状图Fig.7　The results of bending maximal load recovery rate of femur at 2 and 8 weeks after fracture

图8　骨痂HE染色结果Fig.8　HE staining of callus

3　讨论

3.1金天格胶囊的特点［12］虎骨是猫科动物虎的骨骼，在传统中医药中以虎骨入药具有悠久历史，其功效主要是祛风止痛和强筋骨，可以很好缓解骨质疏松症所出现的腰酸背痛，膝软无力，步履艰难等症状，从而在一定程度上减少了骨质疏松症所带来的骨折隐患。目前虎的数量已非常稀少，处于濒临灭绝的危险，各国政府都制定了相关的法律保护，严禁虎制品买卖和入药，中国已于1993年5月将虎骨从《中国药典》中删除。但虎骨入药的疗效历来都获得肯定，为了满足传统中医药治疗疾病的需要，寻找虎骨的良好替代品已成为临床上需要迫切解决的问题。金天格胶囊的原料药又称为人工虎骨，是由国家卫生部立项研发的课题，由中国药品生物制品检定所利用仿生学原理研制成功，其所含成份与天然虎骨基本相同。

3.2金天格胶囊对骨折愈合的影响本研究在大鼠长骨干骨折模型的基础上，使用金天格胶囊对骨折大鼠给予干预，观察该方对骨折愈合的影响。本研究分别从生物力学、骨痂显微结构、骨影像学以及组织形态学水平对骨折愈合进行了评价。结果显示，在骨折早期口服金天格胶囊可以使骨折端的软骨痂增大，晚期可增加骨痂的矿化水平，促进了骨痂生物力学性能的提高。

研究结果提示，金天格胶囊对骨折愈合有很好的促进作用［13］，其机制为金天格胶囊是天然虎骨粉的代用品，属国家一类新药，其原料药来自动物骨骼，含丰富的骨胶原蛋白，是参与骨形成的重要有机基质；人工虎骨粉不但能增加血钙水平，增加骨密度，提高骨强度及韧性，也能减少骨吸收，其抗骨质疏松机制可能与其含有高量钙，具有直接补钙的作用有关［14-15］。同时有研究显示金天格胶囊可改善大鼠骨内微结构，可能通过提高碱性磷酸酶活性，降低耐酒石酸酸性磷酸酶活性，增加骨密度，具有促进骨形成抑制骨吸收的功效，且与天然虎骨的作用相近［16-17］。

从骨折愈合后期的生物力学性能评价以及骨折矿化程度分析，该方剂能加速骨折大鼠骨痂的矿化以及骨折愈合时间，明显改善骨折部位的生物力学性能，对骨痂内钙盐的沉积有促进作用。可能由于虎骨能促进成骨细胞、破骨细胞碱性磷酸酶和酸性磷酸酶的合成与释放，促进骨折断端钙磷的沉积，促进骨痂的矿化［16］。

3.3本研究的优势和局限性在本研究中，从传统X线评分角度观察骨折愈合，显示是否给予金天格胶囊对于骨折愈合没有明显差异。但本实验通过Micro-CT技术重建了大鼠骨折端骨痂的数字化三维图像，并进行定量分析，得到了骨痂的相关形态学参数。在离体空间更精确地反应了骨痂形态和骨痂矿化的过程，明确了给予金天格胶囊在骨折早期和后期对骨折愈合的不同影响。同时，也体现了Micro-CT技术可以作为一种新的手段对骨折愈合进行评价的优势［18］。

本研究的局限性在于：骨折愈合是一个动态的过程，骨的重塑过程持续很久。本研究选择的时间点为两个，仅反映了药物对骨折早晚期的作用效果，尚不能明确该药物的远期疗效。该药物对骨折愈合影响的具体机制尚需进一步的研究。由于样本量有限，可能影响本研究结果的稳定性。

4　结论

金天格胶囊在大鼠骨折愈合早期，可以促进血肿机化及软骨痂的形成，在大鼠骨折愈合晚期可以加速骨痂的矿化并提高骨痂的生物力学性能，最终促进骨折的愈合。由此可见，金天格胶囊有很好的促进骨折愈合的效果，但在骨折不同时期，应用该方剂对骨折愈合影响的表现不同。

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（本文编辑：马英，张震之）

Effects of Jintiange capsules in treating fracture healing and in microstructure of bone in rats

ZHANG Wei-ran1，2，LU Jun1，2，SONG Dong-hui1，2，ZENG Xian-fan1，2，WANG Wei1，2，YANG Jie1，2
（1.Orthopedic Department，Tianjin Gong’an Hospital，Tianjin 300042，China；2.Foot and Ankle Institute，Tianjin Gong’an Hospital，Tianjin 300042，China）

［Objective］To evaluate the effects of Jintiange capsule in treating fracture healing in rats.［Methods］The 40 Spragu-Dawley rats were divided into two groups randomly.Left femoral shaft fractures were created in all rats closely，and treated with intramedullary nail.The rats of experimental group were administrated with Jintiange capsule.The rats of control group were given water.The rats were sacrificed at 2 and 8 weeks.Parameters of callus in two groups were evaluated by Micro-CT.Endura TEC ELF 3200 mechanical testing machine was used to evaluate the biomechanical effect of fractured femoral shaft.Moreover，the fracture healing was also evaluated by X-ray.［Results］At 2 and 8 weeks，there was no significant difference in fracture healing evaluated by X-ray between two groups.The total volume（TV）in callus in experimental group was higher than control group in 2 weeks，but no difference in bone volume（BV），BV/TV and biomechanical property.At 8 weeks，the experimental group was significant in BV，BV/TV and biomechanical property compared with control group，but not in TV.［Conclusion］Jintiange capsule can enhance the fracture healing in rats by increasing callus formation in early phase and improving mineralization in later phase.

traditional Chinese medicine；fracture；animal model；Micro-CT；treatment

R683.4

A

1672-1519（2015）05-0286-05

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.05.09

天津市公安局科技基金项目（2013KYSGAY033）。

张蔚然（1979-），男，医师，研究方向为创伤骨科、关节、脊柱矫形等。

陆军，E-mail:junlu0419@163.com。

（2014-12-20）