散发性乳腺癌中DNMT3a、DNMT3b表达与ERα基因启动子甲基化状态及蛋白表达的关系

王勇，王晓东，陈文捷，于兆进，吴慧哲，赵琳，魏敏杰△

散发性乳腺癌中DNMT3a、DNMT3b表达与ERα基因启动子甲基化状态及蛋白表达的关系

王勇1，王晓东2，陈文捷2，于兆进2，吴慧哲2，赵琳2，魏敏杰2△

目的 探讨散发性乳腺癌中DNA甲基转移酶（DNMT）3a、DNMT3b蛋白表达情况及其与雌激素受体（ER）α基因启动子甲基化状态及蛋白表达的关系。方法 选取180例散发性乳腺癌与30例乳腺纤维腺瘤组织，采用免疫组化法检测组织中DNMT3a、DNMT3b蛋白的表达情况，甲基化特异性PCR检测97例散发性乳腺癌中ERα基因启动子的甲基化状态。结果 乳腺纤维腺瘤与乳腺癌组织中的DNMT3a、DNMT3b蛋白阳性表达率差异无统计学意义；Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌组织的DNMT3a、DNMT3b水平高于Ⅰ～Ⅱ期，有淋巴结转移者的DNMT3a表达水平高于无淋巴结转移者（均P＜0.05）；97例乳腺癌中有39例（40.2%）发生ERα基因启动子甲基化，DNMT3a蛋白阳性表达与ERα基因甲基化呈正相关（rs=0.250）；DNMT3a蛋白表达对患者的总体生存期（OS）有显著影响（P=0.035），对无病生存期（DFS）无明显影响（P=0.064），DNMT3b蛋白表达对患者的OS和DFS无影响（P分别为0.914、0.961）。结论DNMT3a、DNMT3b阳性表达与乳腺癌侵袭转移、病程进展、预后相关；DNMT3a与ERα基因启动子甲基化状态呈正相关；抑制DNMT3a、DNMT3b蛋白可能有利于散发性乳腺癌的预防和治疗。

散发性乳腺癌；DNMT3a；DNMT3b；ERα；DNA甲基化；启动区（遗传学）

DNA甲基化是一个基因表达控制过程中的表观遗传标记，DNA甲基化修饰是最常见的表观遗传学改变方式之一，由DNA甲基转移酶（DNA Methyltransferases，DNMTs）催化完成，在功能上等同于遗传改变，可逆转导致基因沉默。DNMTs家族中的DNMT3a和 DNMT3b参与 DNA从头甲基化［1］，DNMT3a、DNMT3b蛋白在多种恶性肿瘤如肝癌、肺癌、胃癌中过表达［2-4］。雌激素及雌激素受体（ER）α在乳腺癌发生发展过程中发挥了重要作用［5］。ERα是乳腺癌内分泌治疗药物的重要靶点，ERα失表达可导致乳腺癌对此类药物耐受［6］。对散发性乳腺癌组织的研究表明，DNA甲基化可造成ERα蛋白失表达［7-8］。国内有关乳腺癌与DNMT3a、DNMT3b及ERα基因启动子甲基化的相关研究较少。本研究旨在研究DNMT3a、DNMT3b蛋白表达、ERα基因甲基化、ERα蛋白表达对散发性乳腺癌预后的影响，为阐明DNMT3a、DNMT3b蛋白在散发性乳腺癌发生发展过程中的作用提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集中国医科大学附属第一医院外科2004—2014年收治的散发性乳腺肿瘤患者210例，其中乳腺癌180例，乳腺纤维腺瘤30例。180例乳腺癌患者中，导管癌162例，小叶癌13例，其他类型癌（黏液癌、髓样癌、筛状癌）5例。乳腺癌患者年龄27～89岁，平均（50.74±10.37）岁。患者术前均未接受放疗或化疗。178例术前检测了ERα蛋白的表达水平，82例ERα蛋白表达阳性（46.1%）。

1.2 主要试剂 兔抗人DNMT3a、DNMT3b多克隆抗体购自Santa Cruz Biotechnology，UltraSensitiveTMS-P超敏浓缩试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司，DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司（LI-9032/9033）。

1.3 免疫组化法检测乳腺组织中DNMT3a、DNMT3b的表达 取乳腺癌和乳腺纤维腺瘤组织标本，经多聚甲醛固定、石蜡包埋，切成厚4 μm的切片，固定在载玻片（经多聚赖氨酸处理）上，二甲苯脱蜡，降梯度乙醇脱苯、水化。将切片浸入pH 6.0的柠檬酸盐缓冲液，80 kPa高压修复10 min。切片经3%过氧化氢/甲醇，37℃孵育30 min以阻断内源性过氧化物酶的活性，并用10%非免疫性正常山羊血清37℃孵育30 min封闭组织胶原位点。切片滴加DNMT3a、DNMT3b多克隆抗体（DNMT3a1∶200稀释；DNMT3b1∶100稀释），4℃孵育过夜，Western blot分析验证抗体特异性。次日切片滴加生物素标记的二抗（1∶200稀释），37℃孵育30 min，再滴加链霉菌抗生物素蛋白-辣根过氧化酶（S-P）复合物，37℃孵育30 min。切片经PBS浸洗后滴加新鲜配制的3，3-二氨基联苯胺（DAB）溶液显色，苏木素复染，脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，观察。同步采用PBS液代替DNMT3a、DNMT3b抗体作阴性对照，其他步骤不变。

DNMTs蛋白细胞核表达视为阳性表达。由2位有经验的临床病理医生对染色结果进行盲法评价。结果评定采用Allred score积分［9］，指肿瘤细胞阳性细胞百分比计分（阴性计为0，＜1%计为1，≤1%～10%计为2，＜10%～33%计为3，＜33%～66%计为4，＞66%计为5）与染色强度计分（无染色计为0、弱阳性计为1、中等强度计为2、强阳性计为3）之和，范围0～8分。总分≤2计为阴性，＞2计为阳性。

1.4 甲基化特异性PCR法检测乳腺癌组织ERα基因启动子甲基化状态 提取的DNA经检测光密度（OD）值发现只有97例组织DNA浓度能够达到甲基化特异性PCR的要求，提取97例癌组织标本总DNA，溶于50 μL TE缓冲液（Tris和EDTA配制而成），紫外分光光度计测定OD260和OD280，计算DNA浓度，以50 μL超轻水（DDW）溶解1 μgDNA，采用亚硫酸盐和Wizard微型柱修饰并纯化总DNA，然后进行PCR扩增，引物见表1。反应条件：94℃预变性10 min，其间加入rTaq DNA聚合酶；94℃变性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸45 s，38个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物用3%琼脂糖凝胶，100 V，70 mA电泳30 min后，0.1%溴化乙锭染色15 min，凝胶成像系统照相分析。采用SssI甲基化酶修饰的人外周血淋巴细胞基因组DNA作为甲基化特异性PCR扩增阳性对照模板，以去离子水作为空白对照。

Tab.1 Primers used for methylated（M）and unmethylated（U）sequences in ERα MSP表1 ERα甲基化（M）和非甲基化（U）引物表

1.5 统计学方法 采用SPSS 11.5进行数据分析，不同组别间蛋白表达水平比较采用χ2检验，相关分析采用Spearman相关，采用Log-rank分析DNMT3a、DNMT3b、ERα基因甲基化、ERα蛋白表达与散发性乳腺癌预后的关系，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DNMT3a、DNMT3b蛋白在散发性乳腺癌组织中的表达情况 2组的DNMT3a、DNMT3b蛋白阳性表达率差异无统计学意义，见表2、图1。

Tab.2 DNMT3a and DNMT3b expressions in breast cancer and breast fibroadenoma表2 DNMT3a、DNMT3b蛋白在乳腺癌和乳腺纤维腺瘤组织中的表达 例（%）

Fig.1 Immunohistochemical staining of DNMT3a and DNMT3b proteins in breast fibroadenoma and breast cancer（×400）图1 DNMT3a、DNMT3b蛋白在乳腺纤维腺瘤和乳腺癌中的表达情况（免疫组化染色，×400）

2.2 DNMT3a、DNMT3b蛋白与乳腺癌患者临床病理资料的关系 Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌组织的DNMT3a、DNMT3b水平高于Ⅰ～Ⅱ期，有淋巴结转移者的DNMT3a表达水平高于无淋巴结转移者（均P＜0.05），DNMT3a、DNMT3b蛋白表达与患者年龄、绝经状态、肿瘤大小、肿瘤类型以及组织学分级无明显关联（P＞0.05），见表3。

2.3 乳腺癌组织中 ERα基因启动子甲基化状态 97例中有39例（40.2%）发生ERα基因启动子甲基化，58例（59.8%）未发生ERα基因启动子甲基化，见图2。

2.4 DNMT3a、DNMT3b与ERα基因甲基化及蛋白表达的相关性 DNMT3a阳性表达与ERα基因启动子区甲基化呈正相关，与ERα蛋白表达不相关；DNMT3b阳性表达和ERα基因启动子区甲基化、ERα蛋白表达均不相关，见表4。

2.5 DNMT3a、DNMT3b蛋白表达与散发性乳腺癌预后的关系 检测DNMT3a、DNMT3b蛋白表达的180例患者中138例患者的总体生存期（OS）和无病生存期（DFS）资料完整，生存分析显示，DNMT3a蛋白表达对患者的OS有显著影响（P=0.035），对DFS无明显影响（P=0.064），DNMT3b蛋白表达对患者的OS和DFS均无影响（P分别为0.914、0.961），见图3。

2.6 ERα基因甲基化与散发性乳腺癌预后的关系 检测ERα基因启动子区甲基化状态的97例患者中66例的OS和DFS资料完整，其中ERα基因启动子区发生甲基化23例，未甲基化43例，log-rank分析显示ERα基因启动子区甲基化状对患者的OS和DFS均无明显影响（P分别为0.971、0.951），见图4。

Tab.3 Association of DNMT3a，DNMT3b expressions with clinicopathological features of breast cancer表3 DNMT3a、DNMT3b表达和乳腺癌患者临床参数的关系 例（%）

Fig.2 Detecting of the state of promoter methylation of ERα gene图2 患者ERα基因启动子甲基化

Tab.4 Association of DNMT3a，DNMT3b expressions with ERα protein expression and ERα gene methylation status表4 DNMT3a、DNMT3b表达和ERα基因甲基化及ERα蛋白表达的相关性 （rs）

Fig.3 The association of DNMT3a，3b proteins expression with OS and DFS of sporadic breast cancer图3 DNMT3a、DNMT3b蛋白表达与散发性乳腺癌OS和DFS的关系

2.7 ERα蛋白与散发性乳腺癌预后的关系 178例乳腺癌患者检测了ERα蛋白表达水平，其中生存资料完整者136例。结果表明ERα蛋白表达对患者的OS和DFS无明显影响（P分别为0.676、0.828），见图5。

3 讨论

多种恶性肿瘤中均有DNMTs蛋白表达水平升高，但在乳腺癌的相关研究中，仅有报道显示DNMTs mRNA水平增高［10］，尚缺少关于DNMTs蛋白水平的报道。Ben等［11］研究证实DNMT3a、DNMT3b蛋白的表达水平在散发性乳腺癌患者中增高。本研究检测了180例散发性乳腺癌和30例乳腺纤维腺瘤的组织样本中DNMT3a、DNMT3b蛋白表达情况，结果显示乳腺癌组织中DNMT3a、DNMT3b的阳性表达比例数值上虽然高于乳腺纤维腺瘤，但差异无统计学差异，考虑可能是样本例数较小所致。

Fig.4 The association of ERα gene methylation with OS and DFS of sporadic breast cancer图4 ERα基因甲基化与散发性乳腺癌OS（A）和DFS（B）的关系

Fig.5 The association of ERα protein expression with OS and DFS of sporadic breast cancer图5 ERα蛋白与散发性乳腺癌OS（A）和DFS（B）的关系

本研究发现DNMT3a、DNMT3b表达与乳腺癌淋巴结转移及 TNM分期有关，生存分析显示DNMT3a蛋白表达对患者的OS有显著影响，提示DNMT3a参与了乳腺癌的发生发展过程，DNMT3a、DNMT3b高表达与乳腺癌侵袭转移、病程进展及预后相关。研究亦证实，DNMTs的过表达可导致乳腺癌细胞中抑癌基因的高甲基化而失表达［12］。本研究检测了乳腺癌患者ERα基因启动子甲基化状态，发现DNMT3a表达水平与ERα基因甲基化水平显著正相关，而与ERα蛋白表达水平不相关。

本研究进一步分析了ERα基因启动子区甲基化以及蛋白表达对患者预后的影响，结果显示二者对患者OS、DFS均无显著影响。但已有的报道多显示ERα蛋白失表达与患者的预后不良有关［13］。本研究并未得到类似的结果，可能与本研究样本量较小有关，进一步增加样本量进行研究可能会得到有意义的结果。

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（2014-10-21收稿 2014-12-15修回）

（本文编辑 闫娟）

The association of DNMT3a，DNMT3b expression with the state of promoter methylation of ERα gene and ERα expression in sporadic breast cancer

WANG Yong1，WANG Xiaodong2，CHEN Wenjie2，YU Zhaojin2，WU Huizhe2，ZHAO Lin2，WEI Minjie2△
1 Department of Pharmacology，China Medical University，Shenyang 110013，China；2 Department of Pharmacology，The Pharmaceutical School of China Medical University
△Corresponding Author E-mail:mjwei@hotmail.com

Objective To investigate the correlationship between DNMT3a，DNMT3b protein expressions and the state of promoter methylation of ERα gene and ERα protein expression in the development of sporadic breast cancer.Methods A total of 180 patients with sporadic breast cancer and 30 patients with breast fibroadenoma were included in this study.The expressions of DNMT3a and DNMT3b protein were detected by immunohistochemical method.The state of promoter methylation of ERα gene was detected by methylation specific PCR in 97 patients with sporadic breast cancer.Results There were no significant differences in positive expression rates of DNMT3a and DNMT3b protein between breast fibroadenoma and breast cancer.There were higher expression levels of DNMT3a and DNMT3b in breast cancer patient ofⅢ～Ⅳstages than those ofⅠ～Ⅱstages.The expression of DNMT3a was significantly higher in patients with lymph node metastasis than that of patients without lymph node metastasis（P＜0.05）.Of 97 cases of breast cancer patients，ERα gene promoter methylation occurred in 39 cases（40.2%）.The positive expression of DNMT3a protein was positively correlated with the ERα gene methylation（rS=0.250）.The DNMT3a protein expression showed a significant influence to the overall survival（OS）in patients of breast cancer（P=0.035），no significant influence to the disease-free survival（DFS）（P=0.064）.DNMT3b protein expression showed no significant influence to OS and DFS of patients with breast cancer（P=0.914 and 0.961）.Conclusion The positive expressions of DNMT3a and DNMT3b are correlated with the invasion，metastasis and poor prognosis of sporadic breast cancer.DNMT3a was positively correlated with the state of ERα gene promoter methylation.The inhibition of DNMT3a and DNMT3b may have advantages in the prevention and treatment of sporadic breast cancer.

sporadic breast cancer；DNMT3a；DNMT3b；ERα；DNA methylation；promoter regions（genetics）

R737.9

A DOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.05.014

辽宁省高校创新团队支持计划资助项目（LT2014016）

1中国医科大学药学院办公室（邮编110013）；2中国医科大学药学院药理学教研室

王勇（1980），男，硕士，主要从事分子肿瘤药理学研究

△E-mail:mjwei@hotmail.com