唑尼沙胺对癫痫大鼠血清及脑组织NO含量及NOS活性的影响

陈芳，刘斌，张静，王薇，孙素真，王丽辉

唑尼沙胺对癫痫大鼠血清及脑组织NO含量及NOS活性的影响

陈芳，刘斌，张静，王薇，孙素真，王丽辉△

目的 探讨新型抗癫痫药物唑尼沙胺对癫痫大鼠血清及脑组织NO含量及一氧化氮合酶（NOS）活性的影响。方法50只健康雄性SD大鼠中随机抽取8只为正常对照组，剩余42只全部腹腔注射戊四氮制成癫痫模型，从中随机抽取24只，以完全随机分组法分为癫痫模型组、唑尼沙胺组及苯巴比妥组，监测各组大鼠经药物干预后血清及脑组织NO、丙二醛（MDA）含量及NOS、超氧化物歧化酶（SOD）的活性变化。结果 35只（83%）大鼠模型制备成功；戊四氮致痫大鼠的脑电图中均可见阵发性癫痫波；与正常对照组比较，癫痫模型组和唑尼沙胺组大鼠的血清和脑组织的NO、MDA含量及NOS活性明显升高，SOD活性下降；苯巴比妥组脑组织NO、MDA含量升高，SOD活性下降，血清MDA含量升高。与癫痫模型组比较，唑尼沙胺组和苯巴比妥组大鼠血清和脑组织NO、MDA含量及NOS活性明显降低，SOD活性升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 唑尼沙胺通过降低脑组织NO含量而发挥其抗癫痫作用。

抗惊厥药；癫痫；戊四唑；一氧化氮；一氧化氮合酶；丙二醛；超氧化物歧化酶；大鼠，Sprague-Dawley；唑尼沙胺

癫痫是人类一种常见的神经系统疾病，其发病机制复杂，可能由多种因素、介质共同参与。有研究显示NO可以作为神经递质，参与癫痫的发作［1-2］。而丙二醛（MDA）作为过氧化反应的代谢产物，可以间接地反映组织中氧自由基含量的变化；超氧化物歧化酶（SOD）可清除体内氧自由基，减轻神经元损伤。本研究以戊四氮致痫大鼠为模型，其癫痫发作与人类相似，并给予新型抗癫痫药物唑尼沙胺及传统抗癫痫药物苯巴比妥干预性治疗，描记大鼠脑电图特点并检测大鼠脑组织和血清NO、一氧化氮合酶（NOS）、MDA及SOD的变化，从而探讨治疗癫痫的可能机制，为癫痫治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级健康雄性SD大鼠50只，体质量（250±20）g（许可证号：1310073，河北医科大学实验动物中心提供）。实验前先将所有动物在实验室饲养7 d，以适应环境。从所有实验动物中随机抽取8只为正常对照组，剩余42只全部腹腔注射戊四氮制成癫痫模型。模型制备成功后，以完全随机分组法抽取24只作为本实验动物，再分为癫痫模型组、唑尼沙胺组及苯巴比妥组，每组8只。

1.2 方法

1.2.1 模型制备 24只大鼠均给予戊四氮溶液45 mg/kg，每24 h腹腔注射1次，注射后均观察40 min，记录致痫大鼠发作的潜伏期、惊厥发作的表现及持续时间。致痫大鼠的癫痫表现形式采用Racine分级评价标准：0级，无反应；Ⅰ级，湿狗样抖动和（或）面肌痉挛，如动须、眨眼及节律性咀嚼；Ⅱ级，颈部肌肉的痉挛，出现点头和（或）甩尾；Ⅲ级，单侧前肢痉挛；Ⅳ级，双侧前肢痉挛，站立位出现；Ⅴ级，全身强直、阵挛，失去平衡、跌倒。观察实验大鼠在造模过程中出现以上分级中的Ⅳ～Ⅴ级表现，提示戊四氮点燃成功。正常对照组在同期给予同等容量的生理盐水腹腔注射。

1.2.2 脑电图（EEG）监测 从每组实验大鼠中抽取2只行脑电图监测：先用10%的水合氯醛35 mg/kg腹腔注射，麻醉大鼠后固定于固定架上。再用头皮针样电极的单极导联法，连续描记2 min的脑电图。脑电图灵敏度20 μV/mm，时间常数为0.1 s。每次记录前均在彩色显示器上观察信号，待信号基线平稳后再将信号存入计算机硬盘。放置电极位置及导联：单极导联法；取2根0.5寸（15 mm）针灸毫针为记录电极，分别刺入大鼠头顶部中线两侧的头皮下，再将导线连接到脑电图的信号输入设备，大鼠尾根部也需放置电极，接地。在每只大鼠的第6次癫痫发作时描记脑电图，先观察行为学变化，再记录脑电图变化。

1.2.3 药物剂量及途径 造模成功后30 min，唑尼沙胺组给予唑尼沙胺45 mg·kg-1·d-1灌胃；苯巴比妥组给予苯巴比妥30 mg·kg-1·d-1灌胃；正常对照组、癫痫模型组给予同等体积的生理盐水。每日1次，于上午11：00前给药，连续给药14 d。

1.2.4 标本的采集和测定 所有动物在实验2周时称质量后，首先将大鼠以戊巴比妥钠40 mg·kg-1腹腔注射麻醉后，仰卧位固定在手术板上，经腹主动脉采血法采血3～4 mL后断头取出整块脑组织。用吸水纸粘去多余水分，将脑组织称质量，取一侧大脑半球，经福尔马林固定后行病理切片观察；另一侧大脑用生理盐水按1 g∶9 mL比例制成10%的脑组织匀浆，取上清液，冰冻-70℃待测。待所有脑组织及血清标本留取完毕后从冰箱取出，常温融化后按照各试剂盒说明书操作步骤检测血清和脑组织的NO、MDA含量及NOS、SOD活性。

1.3 统计学方法 使用SPSS 16.0统计软件进行数据分析。计量资料先行正态性检验，服从正态分布的资料用x ±s表示。方差齐性检验后，多组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 癫痫大鼠的特征 共给42只SD大鼠注射戊四氮，其中有2只（4.8%）大鼠有Ⅴ级发作持续10 min以上而死亡。所有大鼠均在第1次腹腔注射戊四氮后出现Ⅲ级及以上惊厥发作，38只（90%）可在第2次注射戊四氮后达到RacineⅣ级及以上。第3次戊四氮腹腔注射后，5只未达RacineⅣ级发作。最终35只（83%）模型制备成功。

2.2 EEG改变 正常对照组的脑电图表现为低中幅、相对对称的正常脑电波，见图1。戊四氮致痫大鼠脑电图表现为：基本背景节律下可见阵发性癫痫波，见图2。唑尼沙胺组及苯巴比妥组大鼠经药物干预，脑电波中的棘波减少，背景节律较规整。

2.3 各组大鼠血清和脑组织NO、MDA含量及NOS、SOD活性的变化 与正常对照组比较，癫痫模型组和唑尼沙胺组大鼠的脑组织和血清的NO、MDA含量及NOS活性明显升高，SOD活性下降；苯巴比妥组脑组织NO、MDA含量升高，SOD活性下降，血清MDA含量升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与癫痫模型组比较，唑尼沙胺组和苯巴比妥组大鼠血清和脑组织NO、MDA含量及NOS活性明显降低，SOD活性升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1、2。

Tab.1 Changes of NO，MDA content and NOS，SOD activity in rat brain tissues表1 各组大鼠脑组织NO、MDA含量及NOS、SOD活性的变化 （n=8，x±s）

Tab.2 Changes of serum NO，MDA content and NOS，SOD activity in three groups of rats表2 各组大鼠血清NO、MDA含量及NOS、SOD活性的变化 （n=8，x±s）

3 讨论

癫痫是一种长期反复发作的慢性神经系统疾病，人们对癫痫发病机制及治疗的研究主要依靠动物模型。戊四氮为兴奋中枢神经系统的药物，根据其药代动力学特点，此药物可以引起动物抽搐的迅速发生，并且这种抽搐发作可以迅速达到高峰，持续较短，能自动停止，同时此模型具有不破坏局部脑组织的结构，不伴有神经元损伤、坏死的优点，有利于癫痫脑组织的形态学观察。因此戊四氮致痫的动物模型是研究癫痫的理想动物模型。

目前治疗癫痫的基本方法仍是口服抗癫痫药物。传统的抗癫痫药物如苯妥英、卡马西平、丙戊酸等均因长期服用出现较大的毒性，并且可能存在肝酶代谢异常、半衰期短及产生活性代谢产物等，其不良反应较严重，因此在临床上的应用受到限制［3］。唑尼沙胺是一种新型广谱抗癫痫药，无大多数传统抗癫痫药物（AEDs）所含有的酰腺结构，具有独特的化学结构和广谱的抗癫痫活性［4］。唑尼沙胺作为在难治性部分性发作的癫痫患者添加治疗已显示出其有效性［5-6］，长期治疗也持续有效［7-8］，且相对于传统抗癫痫药物不良反应小。目前已发现此药物可通过多种作用机制发挥治疗癫痫的作用，主要包括：（1）抑制电压依赖性钠离子通道。（2）降低T-型钙离子内流［9］。（3）直接改变一些神经递质的合成、释放和降解，如γ-氨基丁酸（GABA）、多巴胺、5-羟色胺（5-HT）和乙酰胆碱，这些作用可以增强突触抑制。但是，NO及氧自由基在唑尼沙胺抗癫痫作用机制中的作用少见报道。

本研究通过检测血清及脑组织NO、MDA含量和NOS活性，证实了癫痫发作后NO含量升高，引起脑组织损伤；有研究发现丙戊酸钠可以通过减少NO的代谢产物而发挥其抗癫痫作用［10］。而本实验结果显示，经过唑尼沙胺或苯巴比妥治疗后血清及脑组织NO含量及NOS活性降低，提示唑尼沙胺可能通过降低NO含量或NOS活性而发挥其治疗作用。另外，本实验中癫痫组大鼠MDA含量升高，SOD活性降低；而经过唑尼沙胺干预治疗的大鼠与癫痫模型组相比，MDA含量降低，SOD活性升高，提示唑尼沙胺可能通过降低MDA含量或提高SOD活性发挥其神经保护作用。本实验证实了唑尼沙胺抗癫痫治疗的有效性，为临床工作中寻找新的及选用合理的抗癫痫药物提供了依据。

（图1、2见插页）

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（2014-05-26收稿 2014-12-09修回）

（本文编辑 魏杰）

Effects of zonisamide on NO content and NOS activity in serum and brain tissue of epileptic rats

CHEN Fang，LIU Bin，ZHANG Jing，WANG Wei，SUN Suzhen，WANG Lihui△
Department of Neurology，Children's Hospital of Hebei Province，Shijiazhuang 050031，China
△Corresponding Author E-mail:1251680182@qq.com

Objective To investigate the effect of zonisamide as a new antiepileptic drug on nitric oxide（NO）content and nitric oxide synthase（NOS）activity in serum and brain tissue of epileptic rats.Methods Eight healthy rats were used as normal control group，and twenty-four epileptic rats induced by pentrazol were randomly divided into epilepsy model group，zonisamide group and phenobarbital group.Levels of NO and malondialdehyde（MDA）content，NOS and superoxide dismutase（SOD）activity in serum and brain tissue were detected in four groups.Results Forty-two rats were injected pentrazol，and 35（83%）rats were established the rat model successfully.Epileptic waves were visible in EEG of epileptic rats.The concentrations of NO，MDA and the activity of NOS in serum and brain were significantly increased，the activity of SOD was significantly decreased，in epileptic rats than those of control rats.The concentrations of NO and MDA were significantly increased；the activity of SOD was significantly decreased，in brain in phenobarbital group compared with those of control group.There were significantly lower levels of NO，MDA and NOS，and significantly higher level of SOD in serum and brain tissue in zonisamide group and phenobarbital group than those of epileptic model group（P＜0.05）.Conclusion Zonisamide plays an antiepileptic role by reducing the concentration of NO in brain of epileptic rats.

anticonvulsants；epilepsy；pentylenetetrazole；nitric oxide；nitric oxide synthase；malondialdehyde；superoxide dismutase；rats，Sprague-Dawley；zonisamide

R742.1

A DOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.05.007

河北省儿童医院神经内科（邮编050031）

陈芳（1981），女，主治医师，主要从事儿童神经内科研究

△E-mail：1251680182@qq.com