三七三醇皂苷对糖尿病大鼠学习记忆能力及星形胶质细胞活性的影响

李春桃，韩言秀，杜晓薇，左中夫△

三七三醇皂苷对糖尿病大鼠学习记忆能力及星形胶质细胞活性的影响

李春桃1，韩言秀2，杜晓薇2，左中夫1△

目的 探讨三七三醇皂苷（PTS）对糖尿病大鼠学习记忆的改善作用，并从星形胶质细胞角度揭示其机制。方法 24只SD大鼠随机分为对照组、糖尿病组及PTS治疗组，每组8只。于SD大鼠腹腔注射链脲佐菌素诱导糖尿病模型，对照组为正常SD大鼠，PTS治疗组为糖尿病大鼠给予PTS治疗。检测大鼠血糖和体质量，3个月后，水迷宫实验观察各组大鼠的学习记忆功能，免疫组化染色检测脑海马区星形胶质细胞形态，Western blot法检测神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）及胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）表达。结果 糖尿病组较对照组学习记忆能力减退，脑海马区星形胶质细胞胞体萎缩、突起变细，脑海马区GFAP及GDNF表达明显减少（均P＜0.05）。PTS组较糖尿病组学习记忆能力改善，脑海马区星形胶质细胞形态改善、GFAP及GDNF表达明显恢复（均P＜0.05）。结论 PTS能恢复糖尿病大鼠脑海马区星形胶质细胞活性，恢复GDNF表达，提高糖尿病大鼠学习记忆功能。

糖尿病；神经胶质原纤维酸性蛋白质；模型，动物；学习记忆；三七三醇皂苷；星形胶质细胞；胶质细胞源性神经营养因子

糖尿病可使患者学习记忆能力下降，表现为学龄期儿童学习成绩下降，成年人工作能力减退，老年人易患老年痴呆等。1966年“糖尿病脑病”（diabet⁃ic encephalopathy）概念首次提出，但其机制仍未清楚。三七三醇皂苷（PTS）是从三七中提取出的有效药用成分，能改善缺血再灌注的脑功能［1］，营养神经元［2］，调节星形胶质细胞活性［3］，而胶质细胞活性降低是糖尿病学习记忆能力减退的重要原因［4］。但PTS对糖尿病学习记忆能力的影响机制尚不清楚，是否通过星形胶质细胞发挥作用更不明确。本研究旨在探讨PTS对糖尿病大鼠学习记忆功能的影响，并从星形胶质细胞角度揭示其中的细胞及分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料 24只8周龄清洁级雄性SD大鼠，体质量200～ 230 g，购自辽宁医学院实验动物中心；胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）及胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体购自Ab⁃cam公司；链脲佐菌素（STZ）购自Sigma公司；PTS购自成都华神集团股份有限公司制药厂（每粒含PTS 100 mg）。

1.2 动物分组及给药 用随机数字法将24只大鼠分为对照组、糖尿病组及PTS治疗组，每组8只。对照组正常喂养，糖尿病组与PTS治疗组大鼠腹腔注射 1%STZ溶液（60 mg/kg），48 h后测尾静脉血糖，均＞15.0 mmol/L，为糖尿病大鼠模型。对照组及糖尿病组仅给予生理盐水；PTS治疗组大鼠以PTS溶于生理盐水后按100 mg/次，2次/d灌胃给药，均持续3个月。

1.3 水迷宫实验 所有大鼠于给药第4天进行水迷宫定位航行实验，每天4次，连续5 d，水池中平台低于水面1 cm，记录第5天大鼠从入水到登上平台所用时间（逃避潜伏期），检测大鼠学习能力。水迷宫实验第6天（即给药第9天）进行水迷宫空间探索实验，撤去水下平台，记录大鼠游泳速度及穿越原平台所在位置的次数，检测大鼠记忆能力。

1.4 Western blot检测脑海马区GFAP及GDNF表达 大鼠水迷宫实验结束后处死取脑，剥离海马，提取总蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜，分别以β-actin、GFAP及GDNF一抗孵膜，4℃过夜，再以辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育3 h，ECL试剂盒发光显影，以β-actin为内参检测目的蛋白表达量。

1.5 免疫组织化学染色观察脑海马区星形胶质细胞形态 大鼠海马以4%多聚甲醛固定，制备冰冻切片，经10%正常山羊血清封闭后以小鼠抗GFAP（1∶4 000）4℃孵育过夜，再以A488标记的山羊抗小鼠IgG（1∶500）室温孵育4 h，封片，显微镜下观察GFAP染色结果。

1.6 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计分析，符合正态分布的计量资料以±s表示，多组比较用F检验，组间多重比较用LSD-t检验，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠血糖及体质量 分组处理前各组血糖及体质量差异均无统计学意义。3个月后，糖尿病组及PTS治疗组血糖较对照组增高，体质量降低（均P＜0.01），糖尿病组与PTS治疗组之间血糖及体质量差异均无统计学意义，见表1。

Tab.1 Blood glucose and body weight in each group表1 各组大鼠血糖及体质量 （n=8，±s）

Tab.1 Blood glucose and body weight in each group表1 各组大鼠血糖及体质量 （n=8，±s）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，P＜0.01

组别对照组糖尿病组PTS治疗组F血糖（mmol/L）分组处理前4.5±0.4 4.4±0.3 4.2±0.6 7.57 3个月后4.8±0.5 19.2±1.4a20.1±1.8a223.46＊＊体质量（g）分组处理前213.6±4.9 218.6±4.7 221.0±5.3 9.32 3个月后495.3±10.7 321.4±8.6a330.6±7.1a147.67＊＊

2.2 大鼠水迷宫实验 糖尿病组较对照组逃避潜伏期延长，穿越原平台次数减少，第1象限游泳时间百分比下降（均P＜0.01）；PTS治疗组逃避潜伏期、穿越原平台所在位置次数以及第1象限游泳时间百分比较对照组差异均无统计学意义，各组大鼠游泳速度差异无统计学意义，见表2、3。

Tab.2 Performance in water maze and expression of GFAP and GDNF in hippocampus表2 大鼠水迷宫成绩及脑海马区GFAP、GDNF表达（n=8，±s）

Tab.2 Performance in water maze and expression of GFAP and GDNF in hippocampus表2 大鼠水迷宫成绩及脑海马区GFAP、GDNF表达（n=8，±s）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与糖尿病组比较，P＜0.01；表3同

组别对照组糖尿病组PTS治疗组F逃避潜伏期（s）8.4±3.6 12.4±4.8a9.1±5.2b123.70＊＊穿越平台次数4.2±1.2 2.1±0.8a3.8±1.6b165.49＊＊游泳速度（cm/s）26.7±1.7 27.4±5.8 25.1±2.5 14.72 GFAP （%）73.1±4.3 52.6±4.6a71.8±5.7b205.83＊＊GDNF （%）52.1±3.8 32.7±2.5a49.6±3.1b216.79＊＊

Tab.3 Percentage of time spend in each quadrant表3 大鼠水迷宫各象限游泳时间百分比（n=8，%，±s）

Tab.3 Percentage of time spend in each quadrant表3 大鼠水迷宫各象限游泳时间百分比（n=8，%，±s）

组别对照组糖尿病组PTS治疗组F 第1象限39.8±1.7 30.7±1.6a36.5±1.6b98.46＊＊第2象限21.2±1.4 22.9±1.9 20.7±1.2 13.42 第3象限19.6±1.6 22.5±2.6 20.3±2.4 12.53 第4象限19.4±1.2 23.9±1.3 22.5±2.5 13.84

2.3 各组大鼠脑海马区GFAP及GDNF表达 糖尿病组较对照组GDNF、GFAP表达减少（均P＜0.01），而PTS治疗组海马区的GFAP及GDNF表达量较对照组无明显变化（均P＞0.05），见表2、图1。

2.4 PTS对糖尿病大鼠脑海马区星形胶质细胞形态的影响 糖尿病组较对照组脑海马区星形胶质细胞萎缩变小，突起变短、变细；而PTS治疗组较糖尿病组星形胶质细胞形态明显恢复，见图2。

Fig.1 Expression of hippocampal GFAP and GDNF图1 各组大鼠脑海马区GFAP及GDNF蛋白表达

3 讨论

研究显示，糖尿病患者早期学习记忆能力减退不明显，但随着病程的延长，糖尿病对学习记忆功能的损害日益显著，患者工作能力均明显下降，常产生挫败感，进而引发心理问题［5］。对于慢性脑缺血大鼠，PTS能抑制脑组织的氧化应激反应，改善缺血性脑卒中大鼠的学习记忆能力［1］。本研究结果显示，各组大鼠游泳速度无明显差异，表明3个月糖尿病大鼠运动功能未受明显影响。糖尿病组较对照组出现了逃避潜伏期延长、穿越平台次数减少、第1象限（原平台所在象限）游泳时间百分比降低的情况，提示糖尿病大鼠出现了学习记忆功能障碍。PTS治疗组的逃避潜伏期、穿越平台次数、第1象限游泳时间百分比且与对照组无明显差别，提示PTS治疗组较糖尿病组学习记忆功能增强，PTS能改善糖尿病大鼠的学习记忆功能。糖尿病大鼠学习记忆功能的调节受多因素影响，星形胶质细胞活性下降是糖尿病大鼠学习记忆能力减退的重要原因［4］。研究表明，PTS能促进脑缺血大鼠侧脑室下区细胞增殖，提高星形胶质细胞活性［3］。

有研究认为，星形胶质细胞活性改变主要表现为细胞形态变化及GFAP表达变化［6］。本研究显示，糖尿病组较对照组学习记忆能力下降的同时，脑海马区GFAP表达也明显降低，且星形胶质细胞形态也出现了胞体萎缩变小，突起变短、变细等活性降低的形态学改变；而PTS治疗组较糖尿病组学习记忆功能改善的同时，大鼠脑海马区GFAP表达及星形胶质形态较对照组无明显差异，提示PTS可能通过恢复星形胶质细胞活性改善了糖尿病大鼠学习记忆能力。有研究认为，星形胶质细胞可通过分泌多种细胞因子作用于突触间隙，调节突触可塑性，影响突触长时程增强、长时程抑制，从而调节学习记忆能力［7］。GDNF是星形胶质细胞分泌的一种重要神经营养因子，具有促进神经元存活，抑制神经元凋亡，调节学习记忆的功能［8-9］。本研究中糖尿病组较对照组海马区星形胶质细胞活性下降的同时，GDNF表达明显减少，而且学习记忆功能明显减退；PTS治疗组较糖尿病组海马区星形胶质细胞活性及GDNF表达得到了恢复，学习记忆功能也得到改善。因此，笔者认为影响GDNF表达变化可能是PTS恢复糖尿病大鼠脑海马区星形胶质细胞活性，提高认知功能的重要分子机制之一。

（图2见插页）

［1］Zhao JM，Xiao JJ，Shan SD，et al.Effects of notogisenoside on cogni⁃tive impairment，oxidative stress and cognition related genes in rats with chronic cerebral ischemia［J］.Chin J Cerebrovac Dis（Electron⁃ic Edition），2009，3（6）:283-287.［赵江民，肖俊杰，单圣道，等.三七三醇皂苷减轻氧化应激、影响认知相关基因改善慢性缺血性脑血管病大鼠认知功能［J］.中华脑血管病杂志（电子版），2009，3 （6）:283-287］.

［2］Zhu DM，Liu XZ.Protective effects of panax notoginseng of retinal ganglion cells in diabetic rat［J］.Tianjin Med J，2013，41（11）:1103-1105.［朱德淼，刘学政.三七三醇皂苷对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞的保护作用［J］.天津医药，2013，41（11）:1103-1105］.

［3］Chen JP，Ma QS.Effect of PTS on cell proliferation and astrocyte of subventricular zone in rats with cerebral ischemia［J］.China Phar⁃macy，2010，21（43）:4061-4063.［陈俊萍，马祁生.三七三醇皂苷对脑缺血大鼠脑室下区细胞增殖及星形胶质细胞的影响［J］.中国药房，2010，21（43）:4061-4063］.

［4］Zuo ZF，Wang W，Niu L，et al.RU486（mifepristone）ameliorates cognitive dysfunction and reverses the down-regulation of astrocyt⁃ic N-myc downstream-regulated gene 2（NDRG2）in streptozoto⁃cin-induced type 1 diabetic rats［J］.Neuroscience，2011，190:156-165.

［5］Biessels GJ.Sweet memories:20 years of progress in research on cognitive functioning in diabetes［J］.Eur J Pharmacol，2013，719（1-3）:153-160.

［6］Rajkowska G，Stockmeier CA.Astrocyte pathology in major depres⁃sive disorder:insights from human postmortem brain tissue［J］.Curr Drug Targets，2013，14（11）:1225-1236.

［7］Ben Achour S，Pascual O.Astrocyte-neuron communication:func⁃tional consequences［J］.Neurochem Res，2012，37（11）:2464-2473.

［8］Nedergaard M，Verkhratsky A.Artifact versus reality--how astro⁃cytes contribute to synaptic events［J］.Glia，2012，60（7）:1013-1023.

［9］Sopova K，Gatsiou K，Stellos K，et al.Dysregulation of neurotrophic and haematopoietic growth factors in Alzheimer's disease:from pathophysiology to novel treatment strategies［J］.Curr Alzheimer Res，2014，11（1）:27-39.

（2014-03-27收稿 2014-09-30修回）

（本文编辑 陆荣展）

Roles of panaxtrial saponins in cognition and memory of diabetic rat and in activity of astrocytes

LI Chuntao1，HAN Yanxiu2，DU Xiaowei2，ZUO Zhongfu1△
1 Department of Human Anatomy，Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China；2 College of Basic Medical Science，Liaoning Medical University
△Corresponding Author E-mail：zuozhongfu9807@163.com

Objective To explore protective effects of panaxtrial saponins（PTS）on cognition and memory of diabetic rats and to reveal its mechanism by which might involve regulating activity of astrocytes.Methods SD rats（n=24）were ran⁃domly assigned into control，diabetic and PTS-treated groups（n=8 in each group）.Rat diabetic model was induced through streptozotocin injection intraperitoneally.Rats in control group were native rats，and rats in PTS-treated group were diabetic rats that were administered with PTS.Body weight and blood glucose were monitored through the experiments.Three months later，state of cognition was examined by methods of water maze.Hippocampal astrocyte morphology were detected by immu⁃nohistochemistry，and the expression of glial cell line-derived neurotrophic factor（GDNF）and glial fibrillary acidic protein （GFAP）in hippocampus were revealed by Western blot.Results Compared with control group，diabetic group showed cog⁃nitive dysfunction，atrophic astrocyte soma，shrinked astrocyte processes，and down-regulation of hippocampal GFAP and GDNF（P＜0.05）.Compared with diabetic group，PTS-treated group exhibited improved cognition and morphology of hippo⁃campal astrocyte，and reversed expression of GFAP and GDNF in diabetic hippocampus（P＜0.05）.Conclusion PTS re⁃versed astrocytic reactivity as well as expression of GDNF and GFAP in diabetic hippocampus and ameliorated diabetic cog⁃nitive dysfunction.

diabetes mellitus；glial fibrillary acidic protein；models，animal；learning and memory；panaxtrial saponins；astrocytes；GDNF

R742

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.04.008

国家自然科学基金资助项目（81300931）；辽宁省自然科学基金资助项目（2013022055）；辽宁省大学生创新创业训练计划项目（201310160004）；辽宁医学院“校长基金”资助项目（XZJJ20130105-03）；2013年度辽宁医学院大学生科技创新项目

1辽宁医学院解剖学教研室（邮编121001）；2辽宁医学院基础医学院

△E-mail：zuozhongfu9807@163.com