一种新的富集并计数肺癌脑膜转移患者脑脊液中恶性肿瘤细胞的方法

马春华，姜镕，李金铎，王斌，孙立伟，吕远

新技术交流

一种新的富集并计数肺癌脑膜转移患者脑脊液中恶性肿瘤细胞的方法

马春华，姜镕△，李金铎，王斌，孙立伟，吕远

目的 通过观察肿瘤标志物免疫荧光染色-染色体荧光原位杂交技术平台（TM-iFISH）富集并计数肺癌脑膜转移患者脑脊液中的恶性肿瘤细胞，探讨一种新的检测脑脊液中恶性肿瘤细胞的方法。方法 选取6例经脑脊液细胞学或头增强MRI扫描确诊的肺癌脑膜转移患者，每例患者经腰椎穿刺获取脑脊液20 mL（共10份），其中7.5 mL应用TM-iFISH技术富集并计数脑脊液中的恶性肿瘤细胞，10 mL行脑脊液细胞学检查，2.5 mL行脑脊液生物化学检查。结果 10份脑脊液标本均顺利完成上述检测，其中7份标本通过TM-iFISH技术计数示肿瘤细胞数为3～1 823个/7.5 mL脑脊液，3份脑脊液细胞学检查发现肿瘤细胞，9份脑脊液生物化学检查结果蛋白量高于正常值。3例患者治疗后应用TM-iFISH技术再次计数脑脊液恶性肿瘤细胞，2例患者计数较治疗前减少。结论 TM-iFISH技术可以富集并计数肺癌脑膜转移患者脑脊液中恶性肿瘤细胞，可能成为肺癌脑膜转移的诊断和疗效评价方法。

脑膜；癌，非小细胞肺；肿瘤循环细胞；脑膜转移；非小细胞肺癌；脑脊液；肿瘤标志物免疫荧光染色-染色体荧光原位杂交

脑膜转移癌（leptomeningeal metastasis，LM）是指原发病灶的癌细胞在脑膜和脊髓蛛网膜下隙弥漫性播散或呈局灶浸润的一种中枢神经系统转移癌，常继发于白血病、淋巴瘤、肺癌和乳腺癌［1］。未经治疗的脑膜转移癌患者中位生存期仅4～6周，经综合治疗后，其中位生存期仅能达到3～5个月［2］。现阶段早期诊断脑膜转移癌仍为医学难题，主要依据典型中枢神经系统症状、脑脊液细胞学检查和头部MRI增强扫描进行诊断。然而，超过90%的脑膜转移瘤患者没有典型的中枢神经系统的症状和体征；首次脑脊液细胞学检查的阴性率高达45%，第2次脑脊液检查的阳性率达80%；头部强化MRI的特异性几乎能够达到100%，但存在 65%的假阴性率和 10%的假阳性率［3］。因此，寻找一种更为灵敏的方法来检测脑膜的潜在转移是十分必要的。血液循环肿瘤细胞（cir⁃culating tumor cells，CTCs）即脱落入血的实体肿瘤细胞，与肿瘤转移、耐药［4］、预后和复发［5-6］等有明显关联性。肿瘤标志物免疫荧光染色-染色体荧光原位杂交技术平台（tumor marker immunostaining-FISH，TM-iFISH）通过富集和分析技术可有效鉴别生物体液样本中各种非血源性肿瘤上皮细胞并进行计数，目前尚鲜见关于用TM-iFISH技术检测脑脊液中CTCs的文献报道。本研究中采用TM-iFISH技术检测10份脑脊液中的CTCs，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2014年3—9月在我院治疗的非小细胞肺癌脑膜转移患者6例，均为女性，中位年龄57.5岁，原发肿瘤病理类型均为肺腺癌；4例EGFR基因突变、K-Ras基因未突变；1例EGFR和K-Ras基因均未突变；1例基因突变情况未知。主要临床表现为持续性头痛（5例）、认知障碍（3例）、视觉障碍（2例）、耳聋（2例）、马尾综合征（2例）。5例合并脑实质转移。符合以下条件：（1）经组织学或细胞学明确诊断的非小细胞肺癌患者。（2）经脑脊液细胞学或影像学明确诊断的肺癌脑膜转移患者。（3）实验室检查结果无腰椎穿刺术禁忌。（4）经脱水药物治疗后颅内高压症状可获得控制。（5）患者能耐受腰椎穿刺取脑脊液。（6）排除合并脑膜其他病变，如脑膜瘤、室管膜瘤等。（7）签订知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 TM-iFISH检测 腰椎穿刺采集患者脑脊液20 mL，其中7.5 mL储存于TM-iFISH检测专用试管内，常温保存，3 d内应用TM-iFISH技术检测CTCs。（1）免疫磁珠阴性筛选法富集细胞：使用包被抗CD45抗体的免疫磁珠去除CD45阳性的白细胞，将7.5 mL脑脊液制备成100 μL细胞悬液。（2）细胞计数：固定100 μL细胞悬液滴片，分别采用4，6-联脒-2-苯基吲哚（DAPI）染色（阳性表明捕获到的细胞为有核细胞）、8号染色体着丝粒探针（CEP8）检测细胞8号染色体数目、抗细胞角蛋白-18（CK18）抗体染色（阳性表明捕获到的细胞为上皮来源）和CD45抗体染色（阴性表明捕获到的细胞为非白细胞）进行免疫荧光分析。OLYMPUS-BX53荧光显微镜（日本OLYMPUS公司）下进行细胞计数，重复计数5次取平均值作为最终值。10 mL脑脊液行肿瘤细胞学检查，另2.5 mL行生物化学检测。

1.2.2 CTCs判断标准 荧光显微镜下蓝色通道下观察DA⁃PI染色，蓝色荧光者表明为有核细胞；橙色通道下观察CEP8 FISH信号，橙色亮点数目即为8号染色体数目，大多数CTCs 8号染色体呈多倍体，即CEP8阳性，血源性白细胞8号染色体呈二倍体，即CEP8阴性；绿色通道下观察细胞是否表达CK-18，呈绿色荧光即为阳性；红色通道下观察细胞是否表达CD45，呈红色荧光即为阳性。最后在多通道下再次确认细胞为非血源性上皮细胞来源的肿瘤细胞，即呈DA⁃PI+、CD45-、CK18+或CK18-、CEP8+；而呈现DAPI+、CD45+、CK18-、CEP8-时，则表明细胞为血源性白细胞。

2 结果

本组6例患者共10份脑脊液标本顺利通过TM-iFISH技术平台检测，其中 7份脑脊液发现3～1823个/7.5 mL肿瘤细胞，见图1；3例患者治疗后应用TM-iFISH技术再次富集并计数脑脊液中的肿瘤细胞，2例计数较治疗前减少，1例治疗前后均未能富集并计数到肿瘤细胞。3份脑脊液细胞学检查采用HE染色发现肿瘤细胞，但该方法不能对肿瘤细胞进行计数。9份脑脊液生物化学检查结果蛋白量高于正常值。全组患者治疗前、后行头部增强MRI检查均显示脑膜转移征象，但无明显变化。

Fig.1 Image of enriched cells under fluorescence microscope（×400）图1 荧光显微镜下富集的细胞图像（×400）

3 讨论

脑膜转移癌是指原发病灶中的肿瘤细胞转移并弥漫性浸润软脑膜、蛛网膜下腔引起脑组织、脑神经和脊髓受损症状与体征。目前国内诊断脑膜转移癌主要采用以下标准：（1）具有明确的肿瘤病史。（2）新发神经系统症状与体征。（3）典型的MRI表现。（4）脑脊液细胞学检查发现肿瘤细胞。凡具备前2项及第3或4项中的任一项即可确诊。然而，脑膜转移癌的临床表现常因肿瘤细胞侵犯的部位不同而复杂多样，缺乏特异性，与脑实质、脊髓转移引起的症状以及治疗原发肿瘤出现的不良反应很难鉴别［7］。在本研究中，6例患者的主要临床表现为持续性头痛（5例）、认知障碍（3例）、视觉障碍（2例）、耳聋（2例）、马尾综合征（2例），符合脑膜转移癌的主要临床表现。但5例患者合并有脑转移，全组病例均进行了鞘内化疗或静脉化疗。因此临床上很难对上述症状进行鉴别诊断。本研究中9份脑脊液的生物化学检查提示蛋白含量升高，考虑与肿瘤细胞浸润脑膜及其代谢产物的化学刺激，造成血脑屏障的破坏和血管通透性增加，导致蛋白渗出增加有关。脑脊液生物化学检测结果提示脑脊液其检测敏感度较高，但其缺乏特异性，仅能作为临床参考的一项指标。在本研究中，6例肺癌脑膜转移癌患者既往均经脑脊液细胞涂片或头部强化MRI扫描检查明确诊断为脑膜转移癌，但在本研究中仅3份患者脑脊液细胞学检查发现肿瘤细胞，提示脑脊液细胞学检查的随机性较大，且不能计数肿瘤细胞。增强MRI扫描的典型表现为脑膜增厚或伴有结节、脑膜线形或条索样强化、脑膜弥漫性强化，有时可见“尾征”等直接征象，并伴有脑实质容量变小、脑水肿、脑室周围水肿等继发性改变［8］。本组6例患者治疗后复查头部增强MRI扫描均发现脑膜转移癌的典型征象，但均未提示脑膜转移范围存在明显变化，因此增强MRI扫描很难对脑膜转移癌进行疗效评价。笔者认为脑脊液细胞学检查及增强MRI扫描在诊断脑膜转移癌、疗效评价方面不能满足临床医师的需要，因此，寻找更灵敏的检测方式是十分必要的。

肿瘤标志物免疫荧光染色-染色体荧光原位杂交技术平台即TM-iFISH，通过富集技术和分析技术在生物体液标本中有效鉴别各种非血源性肿瘤上皮细胞，对鉴别CTCs具有较高的灵敏性和特异性。研究显示该类技术检测脑脊液中CTCs，进而诊断乳腺癌［3］、恶性黑色素瘤［9］、肺癌脑膜转移［10］具有较高的敏感度。本研究中6例患者共10份脑脊液标本均经TM-iFISH检测富集并计数肿瘤细胞，其中7份脑脊液标本中的肿瘤细胞计数为3～1 823个/7.5 mL。3例患者治疗后再次应用TM-iFISH技术检测脑脊液中的肿瘤细胞，2例患者肿瘤细胞计数较治疗前减少，1例患者治疗前后均未能富集并计数到肿瘤细胞。脑脊液细胞学检查发现肿瘤细胞的3份标本，TM-iFISH检测的肿瘤细胞计数亦高于其余7份标本，二者是否存在相关性尚需进一步研究。本研究结果表明TM-iFISH检测技术对脑脊液中肿瘤细胞具有较高的敏感度，且可计数肿瘤细胞数，在脑膜转移癌的诊断和疗效评价方面较脑脊液细胞学检查、增强MRI扫描表现出一定优势。

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（2014-10-28收稿 2014-11-27修回）

（本文编辑 闫娟）

A novel methodology to concentrate and quantify malignant cells in CSF from lung cancer patients with leptomeningeal metastasis

MA Chunhua，JIANG Rong△，LI Jinduo，WANG Bin，SUN Liwei，LYU Yuan
Department of Intervention，Tianjin HuanHu Hospital，Tianjin Key Laboratory of Cerebral Vascular and Neurodegenerative Disease，Tianjin 300060，China
△Corresponding Author E-mail：jiangrong1989@sina.com

Objective To assess the value of tumor marker immunostaining-FISH（TM-iFISH）technology on concen⁃trating and enumeration of tumor cells in CSF of lung cancer patients with leptomeningeal metastasis（LM）.Methods Six cases of non-small cell lung cancer with leptomeningeal metastasis，which were diagnosed by CSF cytology or enhanced MRI scan，were selected.A total of 20 mL of CSF was collected in each case.TM-iFISH technology was employed to concen⁃trate and quantify circulating tumor cells in 7.5 mL CSF samples in each case while CSF cytology used 10 mL CSF samples in each case；Finally，the rest 2.5 mL CSF in each case was used for biochemistry assay.Results Ten CSF samples from 6 patients with non-small lung cancer with LM were assayed and tumor cells numbers ranging between 3 and 1 823 every 7.5 mL were found in 7 samples.On the other hand，CSF cytology examination only revealed tumor cells in 3 cases.Using CSF biochemical assay，higher than normal of protein level was found in 9 cases.TM-iFISH technology was employed again in 3 cases of patients who received treatment.Tumor cell count in CSF reduced in 2 out of the 3 cases.Conclusion TM-iFISH technology is a new method for detection and enumeration of tumor cells in the CSF in non-small cell lung cancer patients with leptomeningeal metastasis.This technology present diagnosis and curative values in lung cancer patients with leptomen⁃ingeal metastasis.

meninges；carcinoma，non-small-cell lung；neoplasm circulating cells；leptomeningeal metastasis；nonsmall cell lung cancer；cerebrospinal fluid；tumor marker immunostaining-FISH

R742

B

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.04.023

天津市卫生局科技基金资助项目（2014KZ042）

天津市环湖医院肿瘤介入科，天津市脑血管与神经变性重点实验室（邮编300060）

马春华（1981），男，硕士，主治医师，主要从事肿瘤介入化疗研究

△E-mail:jiangrong1989@sina.com