细胞原纤毛与骨相关疾病的研究进展

杨建波，李飞龙，胡 宁，汪长东湖北省老河口市中医医院，湖北 老河口 44800；重庆医科大学基础医学院生物化学和分子生物学教研室，分子医学与肿瘤研究中心，附属第一医院骨科，重庆40006

纤毛存在于体内几乎所有类型的细胞表面，并突出细胞表面［1］，是结构基础为微管的“毛发状”细胞器。研究发现，在机体发育的调节过程中纤毛起着必不可少的作用。在纤毛中，原纤毛是由基于鞭毛轴丝的微管组成，上覆特异的浆膜，并有鞭毛内运输（intraflagellar transport,IFT）的作用。另外原纤毛内没有蛋白的生成，所以蛋白通过微管从细胞器高尔基体处产生后传输到纤毛中，其结构的完整性与许多疾病具有相关性，如关节炎、骨质疏松症、多囊肾疾病、心衰、肥胖和癌症［2-3］。纤毛的絮乱可以导致骨的畸形，此外纤毛相关信号通路如Hedgehog信号通路和Wnt信号通路调控了骨的增殖和发育，而这与纤毛的长度、完整度等相关。本文就纤毛的结构、调控、作用，和其在骨发育、骨相关细胞中作用和纤毛相关骨疾病方面进行综述。

1 纤毛的结构、调控和功能

1.1 纤毛的结构

纤毛长度因细胞类型或生物个体不同而不同，但直径相似。纤毛可以分为三个部分：轴丝、纤毛膜和纤毛基质。轴丝来至于基体(basal body)，由9排环形的双联体微管和其附属的蛋白构成，在中心有一对中心微管，基体是纤毛的基底部，为活动的中心粒，由9个0.4 μm长的圆筒三联体微管构成，相邻的微管由连接丝相连，每个双连体微管由A和B微管组成，沿着A微管有序排列着外动力臂、内动力臂和辐条结构，其参与纤毛的运动；纤毛膜是由细胞膜组成，是细胞膜的延伸，包绕轴丝；纤毛基质填充在轴丝和纤维膜之间。

根据纤毛的运动性和中心微管的有无分为4种纤毛：（1）运动9+2型纤毛；（2）非运动9+0型纤毛；（3）非运动9+2型纤毛；（4）运动型9+0型纤毛。人多数细胞中有一根不动的纤毛，为9+0型纤毛，称为不动纤毛或原纤毛，其不具有和运动相关的蛋白结构，缺少中心微管和动力臂与辐条结构。

1.2 纤毛的调控

纤毛的产生可能是细胞极化的结果，在细胞分裂间期，中心体的中心粒可转化为基体，在基体的基础上，组装纤毛，纤毛形成［4］。纤毛形成的关键蛋白为IFT蛋白，IFT复合体包括20种以上的IFT蛋白，分为两种复合体，即IFT-A和IFT-B复合体［5］，IFT复合体沿轴丝微管进行双向物质运输，包括基底到纤毛顶端的正向运输和顶端到基底的逆向运输，正向运输的IFT由异三聚体驱动 蛋 白 -2（heterotrimeric kinesin-2 motor）调 控 。Rabin8和BBS(Bardet-Biedl syndrome)蛋白复合体直接相互作用，Rabin8对Rab8 GDP/GTP相互交换，另外Rabin8 GTP通过囊泡运输到纤毛基底部，在这和纤毛膜或IFT复合体结合，在基底部，纤毛蛋白在IFT-B复合体的协助下，和细胞驱动蛋白2（kinesin-2 motor）一起把纤毛蛋白转移到纤毛顶，此外IFT-A复合体和细胞质的动力蛋白相互结合进行逆行运输，进行蛋白回收利用。基于这种可控的双向运输机制，纤毛可有序的组装、维持和分解［6］。纤毛的长度可能受感知系统的调控，纤毛的感知系统感知纤毛长度信号，转化为蛋白质翻译后磷酸化，纤毛的组装和解聚是通过磷酸化信号来调节的，从而起到调控其长度的目的［7］。纤毛的组装、维持和分解的调控，影响其结构和长度，并对其功能的实现起到不可忽视的重要作用［8］。

1.3 纤毛的功能

一般来说，纤毛从细胞外转导刺激信号到细胞反应来调控增殖、分化、转录、移行、极化［9］。研究发现，原纤毛有着化学感受器、物理传感器［10］或定位传感器的作用，并且其存在对于细胞的循环和分化有着重要作用。从发现以来，IFT在各种疾病的纤毛中起着重要作用，这些疾病被统一称为“纤毛疾病”，而“纤毛疾病”多与原纤毛有关。普遍认为，在增殖的细胞中纤毛无法形成，但许多增殖的细胞在发育中必须依靠原纤毛来转导信号通路，纤毛组装、分解与细胞周期有着密切的联系。

纤毛在液体运输和细胞运动上有着重要的作用，并且是各种信号通路的感觉中心［11］。研究发现Hedgehog信号在原纤毛上涉及到了受体的结合，Hh配体与Patched（Ptc）受体结合并集中到纤毛上，之后Ptc从纤毛上被排斥，Smoothened（Smo）被激活，转移到纤毛膜上，由于缺乏Hh配体，Gli2和GLI3与负调节蛋白Sufu和Kif7结合，转导到纤毛尖端，Sufu丢失，促进Gli2A和Gli3A的稳定［10］。激活后，GliA通过逆向IFT离开纤毛转导到细胞核去表达相关基因，故纤毛是通过在Gli转导因子之间的激活和抑制来调控基因的表达［12］。同样的，Wnt信号通过不同的Wnt信号配体和在原纤毛上的受体结合而受到调控［13］，但详细过程还需要进一步研究。Hedgehog和Wnt信号都在组织维护和内稳态方面有着重要的作用［14］。另外原纤毛在许多主要的生长因子有关的调控信号通路上起着重要的作用，如PDGR，FGF和Notch信号通路，从而控制细胞增殖行为［4］。

2 纤毛与骨

2.1 纤毛与骨的发育

30年前，原纤毛最先在小鼠骨细胞中发现，其被假设在钙稳态和甲状旁腺激素通路上有重要作用，但却没有进一步的发现。最近的研究表示原纤毛在许多发育过程中起到了重要的作用，并且纤毛絮乱造成了许多骨的畸形，在骨的发育过程中，hedgehog信号通路的SHH和IHH通路与在骨的发育过程中起着不可忽视的作用。研究发现，四肢骨的发育与纤毛有着紧密的联系，纤毛在外胚层和发育的四肢骨间充质干细胞中表达，缺少IFT蛋白IFT88或驱动蛋白Kinesin Superfamily Protein 3a(Kif3a)Kif3a的可以造成多指趾畸形［15-16］，而激活和不激活hedgehog信号是与IFT88和kif3a有关的［15-16］。此外也有研究表明颅骨和牙齿的发育也和纤毛相关。纤毛也作用在关节软骨发育中，与关节软骨病骨性关节炎发病有关，在正常软骨中，纤毛存在于正常关节软骨的浅层、中层、深层，在所有细胞层中，在深层软骨中最多，在鼠组织中可观察到浅层纤毛背离细胞表面［17］，原纤毛对于关节软骨的维持作用可能是基于其纤毛基因的突变，在敲除IFT88基因的小鼠中观察到了在关节软骨细胞浅层细胞形态的改变［18］，此外敲除Kif3a基因的小鼠中观察到了关节形态的改变和关节软骨组织变化［18］。另外有研究表明纤毛影响了骨领的发育，在IFT88和Kif3a表达缺失的转基因鼠中观察到了骨领未能发育，但在只缺失Kif3a表达的转基因鼠中未能发现，说明骨领的发育与软骨膜的纤毛有关，但不仅仅与纤毛的缺失有关［18］，而进一步研究发现，破坏软骨膜的β-catenin表达可以造成一个与缺失IFT88和Kif3a相似的鼠模型的表现［19］，而更早的研究同样显示了IHH信号的缺失造成了骨领的发育缺陷。纤毛在骨中有机械信号转导和化学信号转导的作用。Malone等发现骨细胞是基于纤毛来感应流体流动的，而抑制或敲除IFT88基因发现由于液体流动诱导的OPG/RANKL比值增加被消除，而且骨内机械信号的转导并不依赖于细胞内Ca2+，这与在肾脏和肝脏内发现的纤毛机械信号转导不同［20］。

2.2 纤毛与骨相关细胞

2.2.1 纤毛与骨细胞 在骨组织细胞中约有95%的细胞为骨细胞，越来越多的研究表明在骨代谢中骨细胞起着极其重要的作用，骨细胞能够感知外界的力学刺激，从而分泌活性因子调节成骨、破骨和骨祖细胞［21］。最近研究发现，原纤毛在骨细胞力学传到过程中有重要的作用。对骨细胞进行流体剪切力作用，发现一段时间之后，骨细胞内cAMP含量下降，而COX-2的表达增加，但作用于缺失原纤毛的骨细胞，发现无该作用，提示流体剪切力通过原纤毛来改变骨细胞基因表达。通过原纤毛力学刺激骨细胞后，骨细胞可通过旁分泌可溶性因子来增强骨髓间充质干细胞成骨能力。此外力学刺激骨细胞，可以使调节骨形成和骨吸收的OPG/RANKL信号通路比值增加，促进骨形成并抑制骨吸收，去除原纤毛后，给予相同大小的力学刺激，比值无明显变化，提示原纤毛可以调节OPG/RANKL信号通路，最终抑制骨吸收［22］。

2.2.2 纤毛与成骨细胞 在成骨细胞中，切除纤毛运动蛋白Kif3a可以造成成骨调节的骨形成和相关的信号通路的缺陷［23］，其中有成骨细胞内细胞内钙信号，Shh诱导的Hedgehog和Gli2信号，Wnt-β-catenin和Axin2活化作用。研究表明缺少Kif3a和其基因突变及其表达产物多囊蛋白（Pkd1和Pkd2）在肾脏和骨上可以有相同的表现［24］，另外都表现出不正常的Shh诱导的Hedgehog和Gli2信号，Wnt-β-catenin刺激Axin2转录作用，两者缺少可以表现出成骨细胞细胞分裂增加单基因受损［24-25］，可见Kif3a对成骨细胞的作用可能在于其基因突变及其表达产物多囊蛋白。在经历连续5天的振荡流体流动（OFF）后，成骨细胞的原纤毛长度减少，其可能是通过改变对于负荷的敏感度，避免过负荷或承受小力量［26］，而原纤毛因为负荷降低而长度增加的实验在Mc-Glashan的去除压力的鼠尾肌腱上被观察到［27］，可见纤毛调整其长度来调节其机械信号感应［28］。另外成骨细胞中原纤毛可以通过自身的转换和调整来改变压力，当细胞受到机械信号刺激的时候，细胞骨架变化，包括肌动蛋白重新定位，微管聚合/解聚，调整粘着斑位点［26］。改变细胞骨架变化可以减少细胞内压力［29］。

2.2.3 纤毛与软骨细胞 每个软骨细胞的超微结构可见不能游动的原纤毛，软骨细胞上原纤毛面向细胞外基质，并通过受体和胶原蛋白结合，其物理和化学缺陷导致骨和生长板的不正常。机械刺激调控了基因和信号通路，而原纤毛作为机械刺激感受器可以影响这些基因和通路。软骨在关节负荷的时候经历了许多机械的或物理的刺激，研究发现机械负荷调控软骨原纤毛的发病率和长度［27］，Thompson等研究表明机械负荷可以降低纤毛的长度，纤毛长度降低抑制了hedgehog信号并激活了ADAMSTS-5（A Disintegrin And Metalloproteinase with Thrombospondin Motifs 5）的表达［29］，可见hedgehog信号的激活对于纤毛长度十分敏感，此外有研究发现hedgehog信号的增加促进ASAMSTS-5的表达而促进了软骨的退化。另外在关节软骨的原纤毛底部发现了转录因子HIF-2α，在炎症反应中，原纤毛调控HIF信号通路［30］。可见骨性关节炎病变发生不仅可能直接与纤毛长度增加有关，而且可能与原纤毛调控HIF信号通路有关。另外条件性切除IFT88或Kif3a可以使造成胚胎内软骨形成缺陷，IFT80调控了Hedgehog信号通路和Wnt信号通路，在软骨分化过程中，IFT80高表达，而沉默IFT80，导致纤毛减少，抑制Hh信号通路并上调Wnt信号通路，导致了软骨标记基因胶原蛋白和蛋白聚糖的减少［31］，可见纤毛在软骨分化过程中起到重要作用，而缺少IFT80而导致人ATD和SRPⅢ型［32］疾病可能正是纤毛病变引起软骨分化缺陷所致。

2.2.4 纤毛与骨祖细胞和间充质干细胞 纤毛对于骨祖细胞的作用研究进展不大，但研究发现了在骨祖细胞上原纤毛的存在[33]，但在骨的发育过程中原纤毛起着重要的作用。Tummala等发现在人间充质干细胞（hMSCs）中存在原纤毛［34］，并且hMSCs原纤毛对于化学诱导分化是必要的，当抑制原纤毛时表现为RUNX2，SOX9表达的明显降低，这些表达了hMSCs分化为成骨、软骨基因基础的缺失，而来至高分化组织的原纤毛同样表现出了在重要信号通路的组织和协调，在组织修复和再生过程中有调节作用，尤其是Hedgehog和Wnt信号通络。可见在hMSCs的增殖中原纤毛另外研究发现，短周期的OFF机械信号刺激可以增加成骨基因的表达和hMSCs的增殖，原纤毛的成骨前机械信号转导作用在hMSCs中建立了一个机械力信号转导机制［35］，当缺少原纤毛hMSCs可以增加其增殖率[34]，这同样在肾脏疾病中被观察到，这些发现都可以解释一些关于不受控制的增殖和肿瘤的形成。纤毛相关疾病的发病在于纤毛的损伤而导致了异常的增殖。

2.3 纤毛与其相关骨疾病

基于纤毛的功能，其在骨发育中的重要作用，纤毛的异常而导致了骨的病变，在临床上，与纤毛有关的骨性疾病主要有以下几种：

森森布伦纳综合症（CED）：CED主要表现为颅缝早闭，四肢短小，胸廓狭小，短指，腹部隆起。面部异常，额头突出，双颊饱满，耳朵低下并突出。另有先天性缺牙或小牙，头发稀疏，指甲异常，皮肤松弛及双侧腹股沟疝等。对CED患者基因研究发现，其编码IFT144蛋白的WDR19基因［36］和编码IFT122蛋白的WDR10基因［37］突变，造成了IFT144蛋白和IFT122蛋白的缺失，引起纤毛数量和长度絮乱，而引起了CED的发生。

窒息性胸廓发育不良（JATD）：JATD主要表现是严重收缩的胸廓，短肢并且身材矮小和多指趾畸形可有呼吸功能不全而导致死亡。视网膜病变，可有多囊肾和肝脏病变。研究发现在JATD患者中其WDR34上有总共11个突变点，WDR34的突变影响了其编码纤毛IFT驱动蛋白，同时还抑制了细胞内NF-kB信号通路成分中的TAK1，从而影响了与纤毛相关的Hedgehog信号通路的激活［38-39］。此外Nathalie等在JATD患者身上发现了其DYNC2H1基因的突变，DYNC2H1是胞内驱动蛋白，直接与纤毛的产生和维护相关［40］，纤毛IFT-B复合物中IFT172蛋白的编码基因的缺陷同样发现JATD的发生［41］，而敲除了IFT140蛋白基因的转基因鼠同样出现了类似JATD的病变［42］，这些研究都提示了JATD的发病与纤毛相关基因的突变相关。

埃利伟氏症候群（EVC）：EVC主要表现为多指趾畸形和先天性心脏缺陷，另外还有四肢短小，肋骨、指甲和牙齿发育不良。Nakatomi等研究发现埃利伟氏症候群上缺失了纤毛相关的Evc表达，Evc的缺失可以造成Shh信号通路的絮乱的激活，从而引起埃利伟氏症候群的发生［43］。

短肋-多指综合征（SRPs）：短肋-多指综合征的主要表现是身材短小的侏儒样，胸廓发育不良伴有短肋合并的症状，会出现多指趾畸形，可发生多种内脏畸形，另外基于其内脏畸形和干骺端表现有五种分型。

SRPI型（Saldino-Noonan Syndrome）：SRPI型极其罕见，主要表现为严重短小的鳍状样四肢，长骨干骺端发育不良，多指趾畸形，颅骨、椎骨、盆骨、手脚骨骼分化不全。

SRPⅡ型（Majewski Syndrome）：SRPⅡ型主要表现为胸廓短和窄，肋骨水平，两端光滑的短小长骨，多指趾畸形，胫骨发育不全或卵圆形短小胫骨，可有唇裂、腭裂，会厌、喉、心脏、肾脏、肠、生殖器畸形。

SRPⅢ型（Verma-Naumoff Syndrome）：SRPⅢ型与ATD有关，但更加的严重，胚胎期表现更加明显，并致病性更高，胸廓极端狭小，管状骨极端短小伴圆形的干骺端，伴有唇裂、腭裂，和主要器官的异常，如心、肠道、生殖器、肾、肝脏和胰腺等。

SRPⅣ型（Beemer-Langer Syndrome）：SRPⅣ型主要表现为短和窄的胸廓，水平肋骨和小髂骨，大脑缺陷，内生殖器、肾脏、胆、胰腺缺失SRPⅤ型（SRP Novel）：SRPⅤ型本是一种假定的SRP型疾病，但已经有两例病例被发现，表现有多指趾畸形，偏侧性缺陷，多囊肾，极端短肢，面部畸形等［44］。

对不同表型的SRPs患者基因研究发现，其NEK1、IFT80和DYNC2H1基因上存在缺陷，造成了纤毛的数量减少和形态改变，NEK1与纤毛IFT蛋白有直接交互的作用，DYNC2H1与驱动蛋白相关，此外研究同样发现纤毛微管或中心粒的缺陷程度与SRPs的表型相关［45］，Thiel等［46］]的研究也证实了这个结果，而在JATD患者中同样也观察到了DYNC2H1的突变［41］。Mann等［47］研究发现，聚集在纤毛和中心粒的WDR35的缺陷可以造成纤毛产生的障碍，从而伴随了Hedgehog信号通路的异常，从而引起了人和鼠的SRPs。

骨性关节炎（OA）：OA为退行性骨关节病，在人体可活动关节处关节软骨退行性改变且在关节表面、边缘形成新骨，临床上多表现为一些与骨相关的慢性疾病的症状如关节的疼痛、压痛、僵硬、肿胀、屈伸不便活动受限和出现畸形等。研究发现在中度和重度OA组织中有原纤毛的存在，相比于正常软骨，在OA组织中的纤毛数量和长度伴随着OA的病情程度加深而增多变长,在OA组织中同样发现了能够诱导纤毛伸长的细胞因子白细胞介素IL-1的高表达［48］，此外切除IFT88基因后通过抑制Gli3的表达而降低Hedgehog信号的而导致了一个OA早期症状的表达［49］。

骨质疏松（OP）：OP是由于骨量减少和骨微结构破坏导致骨强度下降，骨的脆性增加从而易于发生骨折的代谢性骨病综合征，临床上多表现为骨痛和肌无力，椎体压缩骨折，长骨骨折。当骨髓间充质干细胞生成的成骨细胞不能抵消破骨细胞对于骨的吸收的时候，则会发生OP，研究发现，纤毛可以通过调节在骨髓间充质干细胞中的机械力传导来调控骨的增殖［50］，另外还有研究发现敲除IFT蛋白基因Kif3a后通过机械负荷作用导致了骨形成的减少，可见纤毛在骨质疏松发病过程中起着重要的作用。

综上所述，纤毛由轴丝、纤毛膜和纤毛基质组成，其形成和调控与鞭毛内运输密切相关，参与了体内信号通路的传导，尤其是Hedgehog信号通路和Wnt信号通路，同时纤毛与骨之间有着紧密的联系，调控了骨的发育，如四肢骨、颅骨、牙齿、关节软骨、骨领等，另外还参与了骨中机械信号、化学信号和分子信号的转导，并在此基础上与许多骨性疾病的发病有关联。

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