骨关节炎治疗的分子靶点研究进展

丁道芳，杜国庆，李玲慧，宋 奕，徐勤光，曹月龙,，詹红生,，郑昱新,上海中医药大学附属曙光医院石氏伤科医学中心；上海市中医药研究院骨伤科研究所，上海 003

骨关节炎(OA)是一种慢性的退行性的关节疾病，是老年人致残的主要的病因之一，以关节软骨的破坏，软骨下骨的硬化和滑膜的炎症为特征，目前对此病的治疗以减轻疼痛和抗炎为主，还无特效药物阻止对关节结构的破坏，因此阻止或延缓关节结构的破坏是骨关节炎治疗的目标。

关节结构的破坏主要是细胞外基质成份的合成和降解平衡失调造成，软骨细胞是关节软骨中的主要细胞，其主要负责胶原蛋白，蛋白多糖和非胶原成份的合成。目前对OA的发病和进展的机制仍不明确，研究发现，众多因素如生长因子、炎症因子和信号通路均参与这个过程。以下就生长因子、相关炎症因素和重要的信号通路做一概述，为OA的治疗提供一些理论依据。

1 生长因子

研究发现，一些生长因子在募集软骨细胞，刺激细胞增殖和增加胞外基质的合成方面发挥重要作用。目前认为IGFs(insulin-like growth factors,IGFs)是关节软骨基质合成中起主要调控作用的细胞因子，其作用可被IGFBPs(IGF-binding protein)结合后抑制，通过小分子抑制剂抑制IGF-1和IGFBPs的结合，可恢复人OA软骨细胞中的蛋白多糖的合成［1］。其它的生长因子如BMPs(Bone morphogenetic proteins,BMPs)和 TGFβ(Transforming growth factors,TGFβ）除了促进软骨中蛋白多糖的合成，同时发现诱导软骨细胞的肥大化、骨赘形成和纤维化，可能阻止它们在软骨修复中的应用［2］。尽管TGFβ3表现出增加软骨形成的潜力［3］，但在实验性OA动物中，导致早期骨赘的形成［4］。在OA中，软骨及释放入滑膜液中的碱性成纤维细胞因子(basic fibroblast growth factors,bFGFs)的表达量明显增加，bFGF通过激活MAPK和NF-ĸB信号通路，增加MMP13的表达，诱导软骨细胞基质的降解［5］。

2 基质降解酶

2.1 基质金属蛋白降解酶

基质金属蛋白降解酶(matrix metalloproteinases,MMPs)可降解细胞外所有的基质成份，合成的MMP抑制剂在动物OA模型中表现出治疗效果，但在临床上，由于广谱的MMP抑制剂的使用，出现严重的骨骼肌副作用［6］，发展特异性的MMP抑制剂将有可能解决这些问题。新型的MMP13抑制剂ALS 1-0635在体外可抑制关节软骨的降解，且在内侧半月板切除的OA大鼠中，未出现骨骼肌副作用［7］。

2.2 Aggrecanases

ADAMTS4和ADAMTS5是负责软骨中蛋白多聚糖aggrecan降解的主要蛋白酶，ADAMTS5-/-基因敲除小鼠关节软骨损伤降低，并且软骨下骨出现轻微的改变，说明ADAMTS5在OA的发生和发展中发挥重要作用［8］。以ADAMTS5为治疗靶点的新型化合物正处在不断的研发和试验过程中。

2.3 金属蛋白组织抑制剂

金属蛋白组织抑制剂（Tissue Inhibitor of metalloproteinases,TIMPs），体内实验表明TIMP3的缺陷导致类似于OA改变的软骨降解［9］。TIMP3除了抑制MMPs还抑制ADAMTSs蛋白酶的活性，尤其对ADAMTS4/5有强烈的抑制作用［10］。近年来，从山毛榉提取出的CaPPS，可同时抑制ADAMTS4和ADAMTS5，同时增加TIMP3对ADAMTS4和ADAMTS5的亲和性，而在TIMP3敲除的小鼠中，发现CaPPS抑制aggrecan的降解依赖于TIMP3的存在［11］。

3 炎性条件

3.1 炎性因子

前炎症细胞因子IL-1β和TNFa在OA中，是引起滑膜炎症和软骨降解的诱导因素，其中IL-1β是导致关节软骨破坏最主要的细胞因子，IL-1β激活降解酶（MMP3,MMP13）促进Ⅱ型胶原和蛋白多糖Aggrecan的降解。目前出现了针对IL-1β受体拮抗剂、抗IL-1β抗体和抗IL-1β受体抗体的药物，例如IL-1β受体拮抗剂进行OA病人的膝关节腔内注射，和安慰剂组相比并无显著疗效［12］，但对于严重手关节炎的病人的疼痛的和功能的恢复取得一些较好的前期结果[13]，目前抗IL-1β的受体的单克隆抗体正在膝关节炎的患者身上进行Ⅱ期临床试验［14］。针对TNF因子也出现了相应的抗体，例如adalimumab在进行三个月的临床治疗观察，虽没有表现出显著的疗效［15］，但从Ⅱ期临床试验的初步数据可看出有减轻关节破坏的趋势［16］，目前Ⅲ期临床试验正在进行中。

3.2 氧化应激

在OA中，随着年龄增长，氧压增加，持续的氧压的存在对软骨细胞和基质的损伤，可能是其病理改变的机制之一。NO和其代谢物在代谢过程中起到双刃剑的作用，NO的产生对于很多生理过程是必要的，但其同时又表现出对细胞的毒性作用和损伤细胞外基质。相对于正常和类风湿软骨细胞，OA软骨细胞表达和产生大量的NO和iNOS(一氧化氮合成酶)［17］。存在OA软骨细胞中的NO和活性氧(ROS)降低IGF-1因子刺激软骨细胞的基质的合成［18］。氧自由基清除剂如C60富勒烯可抑制人软骨细胞在氧化条件下MMP蛋白的表达以及对手术诱导的兔OA模型具有保护效应［19］。在人的OA软骨，IL-1β、TNFa和氧化损伤均引起缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor1a,HIF1a）的表达，HIF1a的表达和关节软骨的退变的呈现相关［20］。

血红素加氧酶HO-1在很多细胞中，都起到对抗氧化反应的作用，OA软骨细胞中的HO-1的表达被IL-1β、TNFa等下调，被IL-10上调［21］。通过HO-1的诱导剂CoPP处理后，HO-1的表达上调可以显著抑制IL-1β介导蛋白多聚糖的降解，增加OA原代软骨细胞中的蛋白多聚糖的合成和Ⅱ型胶原的合成［22］，同样Copp处理软骨-软骨下骨后，发现可以拮抗IL-1β诱导的iNOS、COX2和mPGES-1等炎性因子的表达［23］。这些结果表明HO-1在调控OA软骨细胞外基质的合成和降解过程中发挥重要作用。

4 信号通路

4.1 Wnt/β-catenin通路

相关证据表明，活化wnt/β-catenin通路导致过度的骨重塑和软骨基质的降解及和OA的进展有密切关系［24］，在人的OA软骨中发现Wnt-1诱导的分泌蛋白（wnt-1induced secreted protein-1,WISP-1）的表达增加，在实验性的OA中，此蛋白表达明显上调，可能通过诱导分解代谢因子如MMPs和aggrecase的活性来发挥诱导OA的作用［25］。

调控wnt/β-catenin通路主要有四类分子，分泌型卷曲相关蛋白(secreted frizzled related protein,sFRPs),Wnt抑制因子（wnt inhibitory factors,Wifs），Dickkopf(DKK)分子和sclerostin。其中sclerostin和DKK结合到LRP5/6分子，而Wifs和sFRPs直接结合于Wnt分子发挥抑制信号通路的作用。sFRPs基因的单核酸多态性引起的功能改变和髋关节炎的高风险有关联［26］。而增加血清中的DKK-1水平和减缓白色人种的髋关节炎的进展有一定的关联［27］。

4.2 hedgehog/smoothened通路

除了wnt/β-catenin信号通路，Hh通路在骨关节炎病理中也发挥重要作用［38］，在机械应力的作用下，软骨细胞上的配体Ihh（Indian Hh）和Shh（Sonic Hh）表达［29］，这些配体结合至Ptch1受体上，抑制另一个细胞上的受体Smo（smoothened），导致调节软骨肥大分化的蛋白RUNX2的表达，间接调控ADAMTS5和MMP13等蛋白的表达水平，从而引起OA的改变，抑制Hh通路将减轻OA的严重性［30］。

4.3 NF-ĸB信号通路

NF-ĸB转录因子决定关节中炎症因子和基质分解因子的表达，调控软骨分化过程至肥大化的阶段。在软骨中，NF-ĸB调控着COX2和MMP的表达［31］。基于腺病毒的靶向干扰NF-ĸbp65抑制了手术诱导的大鼠OA的进展［32］，RO100药物拮抗NF-ĸB对OA滑膜中的成纤维细胞的IL-16、MMP1和MMP3的表达抑制效应，和IL-1β及TNFa的抗体具有类似的效应［33］。目前这些通过干扰NF-ĸB通路的治疗方法遇到的最大的问题即这些药物的副反应影响了正常细胞的功能发挥，如何找到只作用于靶细胞的药物尤为必要。

4.4 MAPK信号通路

在兔OA模型中，抑制MAPK-MEK-ERK1/2信号通路可有效抑制OA过程中软骨结构的病理性改变［34］，激活MAPK-MEK-ERK1/2信号通路诱导软骨的降解［35］。应用透明质酸和MAPK-MEK-ERK1/2信号通路抑制剂协同治疗大鼠OA模型，可显著下调软骨退变标志基因COL10和RUNX2及基质降解酶ADAMTS5和MMP13的表达，同时将上调软骨标志基因Ⅱ型胶原表达（COL2a1）［36］。表明MAPK-MEK-ERK1/2信号通路在调控软骨退变中发挥重要作用。

5 展望

信号通路的抑制剂、选择性的抑制基质蛋白酶和抗炎等方法在OA的治疗过程中均取得一定的进展。随着对OA过程中的软骨和骨的改变的分子通路的不断认识和理解，越来越多的潜在OA治疗靶点将得到进一步的评估，即进行体外的细胞学实验和体内的动物学实验，以此发现活性的分子来阻止OA的进展和减轻疼痛。目前多学科交叉的方法和大范围的分子生物学筛查加强了对OA这种多因素疾病的病理过程的认识以及对目前的治疗策略发挥重要作用。

［1］ De Ceuninck F,Caliez A,Dassencourt L,et al.Pharmacological disruption of insulin-like growth factor 1 binding to IGF-binding proteins restores anabolic responsesin human osteoarthritic chondrocytes［J］.Arthritis Res Ther,2004,6(5):R393-403.

［2］ Goldring MB.Are bone morphogenetic proteins effective inducers of cartilage repair?Ex vivo transduction of muscle-derived stem cells［J］.Arthritis Rheum,2006,54(2):387-9.

［3］ Tang QO,Shakib K,Heliotis M,et al.TGFbeta3:A potential biological therapy for enhancing chondrogenesis［J］.Expert Opin Biol Ther,2009,9(6):689-701.

［4］ Blaney DE,Vitters EL,van der Kraan PM,et al.Expression of transforming growth factor-beta(TGFbeta)and the TGFbeta signaling molecule Smad-2P in spontaneous and instability-induced osteoarthritis:role in cartilage degradation,chondrogenesis and osteophyte formation［J］.Ann Rheum Dis,2006,65(11):1414-21.

［5］ Muddasani P,Norman JC,Ellman M,et al.Basic fibroblast growth factor activates the MAPK and NFkappaB pathways that converge on Elk-1 to control production of matrix metalloproteinase-13 by human adult articular chondrocytes［J］.J Biol Chem,2007,282(43):31409-21.

［6］ Li X,Wu JF.Recent developments in patent anti-cancer agents targeting the matrix metalloproteinases(MMPs).Recent Pat Anticancer Drug Discov 2010［J］.5(2):109-41.

［7］ Baragi VM,Becher G,Bendele AM,et al.A new class of potent matrix metalloproteinase 13 inhibitors for potential treatment of osteoarthritis:Evidence of histologic and clinical efficacy without musculoskeletal toxicity in rat models［J］.Arthritis Rheum,2009,60(7):2008-18.

［8］ Botter SM,Glasson SS,Hopkins B,et al.ADAMTS5-/-mice have less subchondral bone changes after induction of osteoarthritis through surgical instability:implications for a Link between cartilage and subchondral bone changes［J］.Osteoarthritis Cartilage,2009,17(5):636-45.

［9］ Sahebjam S,Khokha R,Mort JS.Increased collagen and aggrecan degradation with age in the joints of Timp3(-/-)mice［J］.Arthritis Rheum,2007,56(3):905-9.

［10］Kashiwagi M,Tortorella M,Nagase H,et al.TIMP-3 is a potent inhibitor of aggrecanase 1(ADAM-TS4)and aggrecanase 2(ADAMTS5).J Biol Chem 2001［J］.276(16):12501-4.

［11］ Troeberg L,Fushimi K,Khokha R,et al.Calcium pentosan polysulfate is a multifaceted exosite inhibitor of aggrecanases［J］.FASEB J,2008,22(10):3515-24.

［12］Chevalier X,Goupille P,Beaulieu AD,et al.Intra articular injection of anakinra in osteoarthritis of the knee:a multicenter,randomized,double-blind,placebo controlled study［J］.Arthritis Rheum,2009,61(3):344-352.

［13］Bacconnier L,Jorgensen C,Fabre S.Erosive osteoarthritis of the hand:clinical experience with anakinra［J］.Ann Rheum Dis,2009,68(6):1078-9.

［14］Cohen SB,Proudman S,Kivitz AJ,et al.A randomized,doubleblind study of AMG 108(a fully human monoclonal antibody to IL-1R1)in patients with osteoarthritis of the knee［J］.Arthritis Res Ther,2011,13(4):R125.

［15］Magnano MD,Chakravarty EF,Broudy CA,et al.A pilot study of tumor necrosis factor inhibition in erosive/inflammatory osteoarthritis of the hands［J］.J Rheumatol,2007,34(6):1323-7.

［16］Verbruggen G,Wittoek R,Cruyssen BV.Tumour necrosis factor blockade for the treatment of erosive osteoarthritis of the interphalangeal finger joints:a double blind,randomised trial on structure modification［J］.Ann Rheum Dis,2012,71(6):891-8.

［17］Mazzetti I,Grigolo B,Pulsatelli L,et al.Differential roles of nitric oxide and Oxygen radicals in chondrocytes affected by osteoarthritis and rheumatoid arthritis［J］.Clin Sci(Lond),2001,101(6):593-9.

［18］Studer RK,Levicoff E,Georgescu H,et al.Nitric oxide inhibits chondrocyte response to IGF-I:inhibition of IGF-IRbeta tyrosine phosphorylation［J］.Am J Physiol Cell Physiol,2000,279(4):C961-9.

［19］Yudoh K,Shishido K,Murayama H,et al.Water-soluble c60 fullerene prevents degeneration of articular cartilage in Osteoarthritis via down-regulation of chondrocyte catabolic activity and inhibition of cartilage degeneration during disease development［J］.Arthritis Rheum,2007,56(10):3307-18.

［20］Yudoh K,Nakamura H,Masuko-Hongo K,et al.Catabolic stress induces expression of hypoxia-inducible factor(HIF)-1alpha in articular chondrocytes:involvement of HIF-1alpha in the pathogenesis of osteoarthritis［J］.Arthritis Res Ther,2005,7(4):R904-14.

［21］Fernandez P,Guillen MI,Gomar F,et al.Expression of heme oxygenase-1 and regulation by cytokines in human osteoarthritic chondrocytes［J］.Biochem Pharmacol,2003,66(10):2049-52.

［22］Guillen MI,Megias J,Gomar F,et al.Haem oxygenase-1 regulates catabolic and anabolic processes in osteoarthritic chondrocytes［J］.J Pathol,2008,214(4):515-22.

［23］Clerigues V,Isabel Guillen M,Gomar FA.Haem oxygenase-1 counteracts the effects of interleukin-1 beta on inflammatory and senescence markers in cartilage-subchondral bone explants from osteoarthritic patients［J］.Clin Sci(Lond),2012,122(5/6):239-50.

［24］Shortkroff S,Yates KE.Alteration of matrix glycosaminoglycans diminishes articular chondrocytes'response to a canonical Wnt signal［J］.Osteoarthritis Cartilage,2007,15(2):147-54.

［25］Blom AB,Brockbank SM,van Lent PL,et al.Involvement of the Wnt signaling pathway in experimental and human osteoarthritis prominent role of Wnt-Induced signaling protein 1［J］.Arthritis Rheum,2009,60(2):501-12.

［26］Loughlin J,Dowling B,Chapman K,et al.Functional variants within the secreted frizzled-related protein 3 gene are associated with hip osteoarthritis in females［J］.Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(26):9757-62.

［27］Lane NE,Nevitt MC,Lui LY,et al.Wnt signaling antagonists are potential prognostic biomarkers for the progression of radiographic hip osteoarthritis in elderly Caucasian women［J］.Arthritis Rheum,2007,56(10):3319-25.

［28］Ruiz-Heiland G,Horn A,Zerr P,et al.Blockade of the hedgehog pathway inhibits osteophyte formation in arthritis［J］.Ann Rheum Dis,2012,71(3):400-7.

［29］Ng TC,Chiu KW,Rabie AB,et al.Repeated mechanical loading enhances the expression of Indian hedgehog in condylar cartilage［J］.Front Biosci,2006,11(11):943-8.

［30］Lin AC,Seeto BL,Bartoszko JM,et al.Modulating hedgehog signaling can attenuate the severity of osteoarthritis［J］.Nat Med,2009,15(12):1U11-421.

［31］Shakibaei M,John T,Schulze-Tanzil GA,et al.Suppression of NF-kappa B activation by curcumin leads to inhibition of expression of cyclo-oxygenase-2 and matrix metalloproteinase-9 in human articular chondrocytes: Implications for the treatment of osteoarthritis［J］.Biochem Pharmacol,2007,73(9):1434-45.

［32］Chen LX,Lin L,Wang HJ,et al.Suppression of early experimental osteoarthritis by in vivo delivery of the adenoviral vectormediated NF-kappaBp65-specific siRNA［J］.Osteoarthritis Cartilage,2008,16(2):174–84.

［33］Lauder SN,Carty SM,Carpenter CE,et al.Interleukin-1 beta induced activation of nuclear factor-kappa b can be inhibited by novel pharmacological agents in osteoarthritis［J］.Rheumatology(Oxford),2007,46(5):752-8.

［34］ Pelletier JP,Fernandes JC,Brunet J,et al.In vivo selective inhibition of mitogen-activated protein kinase kinase 1/2 in rabbit experimental osteoarthritis isassociated with a reduction in the development of structural changes［J］.Arthritis Rheum,2003,48(6):1582-93.

［35］Appleton C,Usmani SE,Mort JS.Rho/ROCK and MEK/ERK activation by transforming growth factor-alpha induces articular cartilage degradation［J］.Lab Invest,2010,90(1):20-30.

［36］Prasadam I,Mao XZ,Shi W,et al.Combination of MEK-ERK inhibitor and hyaluronic acid has a synergistic effect on antihypertrophic and pro-chondrogenic activities in osteoarthritis treatment［J］.J Mol Med(Berl),2013,91(3):369-80.