白及薄层色谱鉴别方法的改进和高效液相指纹图谱研究*

杨顺丽，杨枝中，李 龙，彭晓丽，梅双喜

（云南白药集团创新研发中心/云南省药物研究所/云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室，云南 昆明650111）

中药白及为兰科植物白及Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.的干燥块茎[1]，为《中国药典》2010年版一部收载品种。其味苦、甘、涩，微寒，归肺、肝、胃经，具有收敛止血，消肿生肌的功效，用于治疗咳血、吐血、外伤出血、疮疡肿毒、皮肤皲裂；肺结核咳血，溃疡病出血[2]。临床上白及被应用于治疗口腔溃疡、烧烫伤和皮肤病外，还拓展到前列腺手术、肛肠病、妇科肌瘤以及肿瘤栓塞治疗[3-4]。近几年国内外研究表明白及块茎中分离得联苄类、菲类、联菲类、联菲醚类、菲并吡喃类、联苄葡萄糖苷类、菲并螺甾内酯类以及甾体、三萜和花色素苷类等化合物[5-10]。白及是云南省药物研究所研制的肿痛气雾剂等产品的重要原料之一，笔者对原料药质量控制研究中发现，2010 年版《中国药典》对白及的质量控制仅有薄层色谱鉴别，且方法繁琐、效果不理想。笔者优化了白及薄层鉴别条件，改进了薄层鉴别方法，获得了较好的结果，使白及药材的薄层色谱鉴别简便、快速；同时建立了白及药材HPLC 指纹图谱鉴别方法，为进一步完善白及药材质量标准、加强白及质量控制提供科学依据。

1 仪器与试药

LC-2010 高效液相色谱仪（日本岛津公司）；SK8200HP 型超声波震荡器（上海科导超声仪器有限公司）；Mettler Toledo AG 285 电子分析天平（十万分之一）；Heidolph Laborata 4000-efficient 型旋转蒸发仪；可调式封闭电炉（FL-北京光明医疗仪器有限公司），Milli-Q® Advantage A10® systerm 超纯水机（美国Millipore 公司），乙腈为色谱纯（Merck KGaA）；水为自制超纯水；甲醇、环己烷、乙酸乙酯、三氯甲烷、硫酸等试剂均为分析纯。

白及对照药材（批号：121262-201104），购自中国食品药品检定研究院；1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯对照品（militarine，批号：14040233，含量：98.0%），购自上海同田生物技术股份有限公司。

白及药材（批号：BJ-002，BJ-003，BJ-003，BJ-004，BJ-005，BJ-006，BJ-007，BJ-008，BJ-009，BJ-010，BJ-011），采自云南省蒙自县冷泉镇，经云南省药物研究所邱斌高级工程师鉴定为兰科植物白及Bletilla Striata（Thunb.）Reichb.f.的干燥块茎，标本保存于云南省药物研究所标本室。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别改进

按照2010 版《中国药典》白及鉴别项下方法[1]，对白及药材进行薄层鉴别，该方法耗时长，薄层色谱清晰度差，如图1 所示。

图1 白及薄层色谱图（药典方法）

2.1.1 溶液制备

供试品溶液的制备：取白及粉末1g，加甲醇20mL，超声处理（功率350W，频率53Hz）30min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1mL 溶解，作为供试品溶液。

对照药材溶液的制备：取白及对照药材1g，按“供试品溶液的制备”方法制成对照药材溶液。

2.1.2 鉴别

吸取供试品溶液与对照药材溶液各5μL，分别点于同一硅胶板上，以三氯甲烷-甲醇-水（6∶0.5∶0.05）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%香草醛硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。结果表明，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的斑点，如图2 所示。

图2 白及薄层色谱图（改进方法）

2.2 HPLC 指纹图谱研究

2.2.1 色谱条件

色谱柱为Thermo Acclaim 120 C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈（A）-水（B）梯度洗脱（0～15min，18%～30%A；15～60min，30%～50%A；60～65min，50%～18%A）；柱温：25℃；流速：1.0mL/min；检测波长：270nm。

2.2.2 对照品溶液的制备

取militarine 对照品适量，加甲醇溶解制备成浓度为1mg/mL 的溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备

取白及粉末（过三号筛）1.0g，置具塞锥形瓶中，精密称定，加入70%甲醇溶液25mL，称重，超声处理（功率350W，频率53Hz）30min，放冷，再称定重量，用70%甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 方法学考察

2.2.4.1 精密度试验

取同一份供试品（BJ-002）溶液，连续进样6次，测定指纹图谱，结果表明，各共有峰的相对保留时间≤0.32%，相对峰面积RSD≤0.91%，表明仪器精密度良好。

2.2.4.2 稳定性试验

取同一份供试品（BJ-002）溶液，分别于0、3、6、9、12、24h 进样，测定指纹图谱，结果表明，各共有峰的相对保留时间RSD≤0.53%，相对峰面积RSD≤2.43%，表明供试品溶液在24h 内基本稳定。

2.2.4.3 重复性试验

取同一批白及药材（BJ-002）6 份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，并测定指纹图谱，各共有峰的相对保留时间RSD ≤0.45%，相对峰面积RSD≤1.80%，表明方法的重复性良好。

2.2.5 白及药材HPLC 指纹图谱的建立

10 批白及药材样品按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，测定指纹图谱，见图3，通过图谱比较，确定11 个色谱峰为共有峰。Militarine 为白及药材的活性成分之一[11]，且含量较高，以它为参照峰计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积（见表1，表2），militarine 对照品HPLC 色谱图见图4。

2.2.6 白及药材指纹图谱相似度评价

将10 批白及药材的指纹图谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2004 A 版），自动匹配后生成对照图谱（见图5），进行相似度评价，不同批次白及药材指纹图谱相似度均大于0.95，说明不同批次白及药材中化学成分相似度较高，结果见表3。

图3 不同批次白及药材HPLC 指纹图谱

图4 参照峰militarine HPLC 色谱图

表1 10 批白及药材共有峰的相对保留时间（将3 号峰的相对保留时间定为1.00）

表2 10 批白及药材共有峰的相对峰面积（将3 号峰的相对保留时间定为1.00）

图5 白及药材HPLC 特征图谱

表3 10 批白及药材样品相似度

3 讨论

2010 版《中国药典》中白及薄层鉴别采用的展开剂，即环己烷-乙酸乙酯-甲醇（6∶2.5∶1），在室温较高时，易挥发，比例容易发生变化，影响薄层展开的重现性。在薄层鉴别方法改进实验中，笔者摸索了多种展开剂，最终认为文献[12]报道的展开剂三氯甲烷-甲醇-水（6∶0.5∶0.05）展开效果最好，并改用1%香草醛硫酸乙醇溶液为显色剂，薄层色谱图清晰，斑点分离良好，解决了药典方法鉴别耗时长，色谱图清晰度差的问题。此外，改进了供试品溶液制备方法，结果表明白及药材粉末加适量甲醇超声处理，即可获得与药典方法一致的薄层色谱，省去了萃取等繁锁操作，缩短实验时间，提高了工作效率。

在HPLC 指纹图谱研究中，参照文献[13-15]选择流动相系统乙腈-水，考察了不同吸收波长210、254、270nm 下的指纹图谱，结果表明，检测波长为270nm 下色谱图基线较为平稳，各色谱峰的分离良好，且峰面积较为适宜。供试品溶液制备比较了超声和回流提取方法，结果表明采用超声的方法色谱图主成分峰面积略比回流提取大，且方法简便、快捷；同时考察了采用50%甲醇溶液、70%甲醇溶液、甲醇超声提取制备供试品溶液，结果表明，70%甲醇溶液超声提取的色谱峰信息量大，主成分峰面积最大，因此选择70%甲醇提取样品。此外，柱温考察时发现，两个成分峰的分离效果受柱温影响较大，柱温30℃时两峰重叠，25℃和35℃时分离良好，且出峰顺序相反，25℃时各色谱峰分离度较35℃好，因此，将柱温固定为25℃。

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