荧光光谱法研究奥沙利铂与溶菌酶的相互作用

陈晨，张洪峰，王乐，魏亚超

河北省邯郸市中心医院药学部，河北 邯郸 056001

奥沙利铂(oxalip latin)是第三代铂类化合物，它对大肠癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞株，包括对顺铂和卡铂的耐药株均有显著的抑制作用[1]。

为了使抗癌药物能定位于肿瘤组织释放而减少对正常组织带来的毒副反应，选择蛋白质为药物载体的应用日益广泛[2]。溶菌酶(lysozyme，LYSO)是生物体内重要的非特异性体液免疫因子，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、增强免疫力等多种药理作用[3]，能和许多外源性和内源性物质结合，运载多种药物。

本文主要采用荧光光谱法研究了奥沙利铂与LYSO的相互作用，建立结合的体外模型，探讨结合的紧密程度、结合模式、结合部位等问题，所得结果将为药物的联用以及抗肿瘤药物靶向载体的选择提供有利的信息。

1 材料和方法

1.1 仪器和试剂 荧光光谱仪(LS-50B型)；TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；pH计(pHSJ-5实验室pH计，上海精科)；CU600电热恒温水浴箱(上海益恒实验仪器有限公司)。

缓冲溶液为p H=7.4，0.05m o l·L-1的T r i s-HCl(内含0.1 mol·L-1的NaCl)；LYSO(国药集团化学试剂有限公司)1×10-5m o l·L-1，奥沙利铂标准品(中国药品生物制品检定所，批号：100584-200401)1×10-3mol·L-1，均用上述缓冲溶液配制。其余试剂均为分析纯，实验用水为双蒸水。

1.2 实验方法

1.2.1 荧光光谱测定方法 在一系列10mL容量瓶中，加入1m L1×10-5mol·L-1的LYSO溶液和不同量的(0、10、20、30、40、50、60μL)1.0×10-3mol·L-1的奥沙利铂溶液，用Tris-HCl缓冲溶液定容至刻度，摇匀、静置。

荧光发射光谱：准确移取3m L含有不同浓度奥沙利铂的LYSO溶液于石英比色皿中，在298K和310K条件下，分别扫描其荧光发射光谱。以280nm为激发波长(λex)，激发和发射狭缝均为7nm，扫描范围300～420nm。

同步荧光光谱：Δλ=15 nm和Δλ= 60 nm，扫描范围分别为270～315 nm和250～315 nm。

1.2.2 紫外光谱测定方法 扫描300～420nm范围内，1.0×10-6mol·L-1的奥沙利铂溶液的紫外吸收光谱。

2 结果

2.1 荧光光谱特征 LYSO由129个氨基酸残基组成，Trp62和Trp108是LYSO荧光的主要来源[4]。图1是含有不同浓度奥沙利铂的LYSO溶液的荧光发射光谱，从图中可以看出，随着奥沙利铂浓度的增加，LYSO在347 nm处的荧光发射峰强度逐渐降低，且峰位置发生了明显的红移，表明奥沙利铂与LYSO发生了相互作用，LYSO的内源性荧光产生猝灭。

2.2 荧光猝灭机理 根据猝灭机理不同，荧光猝灭分为动态猝灭和静态猝灭，分别遵循Stern-Volmer方程[1]和Lineweaver-Burk双倒数方程[2]：

式中F0为未加入猝灭剂时LYSO的荧光强度；F为加入猝灭剂后LYSO的荧光强度；Kq为双分子猝灭过程的速率常数；τ0为不存在猝灭剂时荧光分子的平均寿命；Ksv是动态猝灭常数；KLB是静态猝灭常数；[Q]为猝灭剂的浓度。

以F0/F对[Q]作图，得到不同温度下的Ksv(表1)。对于动态猝灭，温度升高有利于猝灭过程进行，Ksv随温度的升高而增大；而静态猝灭，温度升高形成的复合物稳定性降低，Ksv减小[5]。从表1中看出随着温度的升高，Ksv减小，可初步判断猝灭过程为静态猝灭。同时，各类猝灭剂对生物大分子的扩散碰撞猝灭常数最大不超过 2×1010L·mol-1·s-1[6]，而实验所得Kq均远大于此值，进一步证明奥沙利铂与LYSO之间主要发生了静态猝灭反应。根据Lineweaver-Burk双倒数方程得到KLB。

2.3 结合常数和结合位点数 根据结合和自由的分子建立化学平衡方程：lg[(F0－F)/F]=lg K a+n lg[Q][3]，得出药物与蛋白质的结合常数K a和结合位点数n，见表2，298K和310K时，奥沙利铂与LYSO的结合位点数均接近于1，表明二者近似以1:1结合生成复合物。

图1 奥沙利铂与LYSO相互作用的荧光猝灭图Fig 1 Fluorescence quenching spectra o f interaction betw een oxalip latin and LYSO C(LYSO)=1.0×10-6m o l·L-1 in all cases; Curve 1→8, C(oxalip latin)/(10-6m o l·L-1):0,1,2,3,4,5,6,7

表1 不同温度下的K sv和K LBTab1 K sv and K LB at d ifferen t tem peratu re

表2 不同温度下的结合常数(K a)和结合位点数(n)Tab2 Bind ing constants(K a) and binding sites(n) at d ifferent tem perature

2.4 非辐射能量转移 根据 Föster's能量转移原理，如果供能体能够发荧光，其荧光发射光谱与受能体的吸收光谱有足够的重叠，并且供能体与受能体的最大距离小于7nm，就可认为供能体与受体之间发生了非能量辐射转移，导致供能体荧光猝灭。临界能量转移距离(R0)、结合距离(r)及能量转移效率(E)符合以下关系[7]：

F(λ)为供能体在波长λ处的荧光强度，ε(λ)为受能体在λ处的摩尔吸光系数，J是供能体荧光发射光谱与受能体紫外吸收光谱的重叠积分。偶极空间取向因子K2=2/3，LYSO中色氨酸残基的量子产率Φ=0.15，介质折射指数n=1.36。计算得出r=4.53nm，小于7nm。由此推断奥沙利铂与LYSO之间发生了非辐射能量转移，促使了LYSO的荧光猝灭。图2为奥沙利铂的紫外吸收光谱与LYSO荧光发射光谱的叠加图。

2.5 作用力类型的确定 有机小分子与生物大分子之间的作用力类型主要有疏水作用力、静电引力、氢键和范德华力等。当ΔH>0，ΔS>0时，分子间的作用力主要是疏水作用力；当ΔH<0，ΔS<0时，主要为氢键和范德华力；当ΔH<0，ΔS>0时，静电引力占主导[8]。当温度变化范围不大时，反应焓变ΔH和熵变ΔS可以近似看做常数。根据热力学方程：

图2 奥沙利铂的吸收光谱(1)与LYSO的荧光光谱(2)叠加图Fig 2 Overlap o f the abso rp tion spectrum o f oxalip latin(1) w ith the fluorescence spectrum of LYSO(2)C(LYSO)=C(oxalip latin)= 1.0×10-6m o l·L-1

求得不同温度下的热力学参数，见表3。

可以看出，ΔG均小于0，即在298K和310K时奥沙利铂与LYSO的相互作用过程都是自发进行的。ΔH<0，ΔS<0，说明奥沙利铂与LYSO之间主要以氢键和范德华力相结合。

表3 不同温度下奥沙利铂与LYSO作用的热力学参数Tab3 Therm odynam ic param eters of the reaction between oxaliplatin and LYSO at different tem perature

图3 奥沙利铂与LYSO相互作用的同步荧光光谱Fig 3 Synchronous fluorescence spectra of interaction betw een oxalip latin and LYSO Δλ=15nm(A)andΔλ=60nm(B)T=298 K, C(LYSO)=1×10-6m ol·L-1 in all cases; Curve 1→7, C(oxalip latin)/(10-6m o l·L-1): 0,1,2,3,4,5,6.

2.6 同步荧光光谱 Δλ=15nm和Δλ=60nm分别体现蛋白质酪氨酸和色氨酸残基的光谱特征。氨基酸残基的最大发射波长与所处环境极性密切相关[9]，根据最大荧光发射波长的改变可判断蛋白质构象的变化。由图3可以看出，随着奥沙利铂浓度的增大，LYSO色氨酸和酪氨酸残基的荧光发射峰均产生红移，说明微环境的疏水性降低，肽链的伸展程度可能增强，氨基酸残基处于更“暴露”的状态中[10]，从而引起了LYSO构象的变化。

3 讨论

LYSO普遍存在于鸟类、家禽的蛋清和哺乳动物的眼泪、唾液、血液、尿液、乳汁和组织细胞中[11]，是一种天然的无毒副作用的小分子碱性蛋白质，奥沙利铂能与其以氢键和范德华力结合生成复合物，选择LYSO作为奥沙利铂的靶向载体，可能会减小其对正常组织的毒副作用，增强抗肿瘤疗效。同时，二者的Ka较小，在血液中较容易分离，奥沙利铂较容易分布到靶组织以及代谢。

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