弓形虫棒状体蛋白16的原核表达及多克隆抗体制备

刘原，杨华，吴亮，苏丹华，付涛，郭雪，刘曼，姜旭淦，陈盛霞，曹建平

（1.江苏大学医学院，江苏镇江212013；2.中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，上海200025）

弓形虫棒状体蛋白16的原核表达及多克隆抗体制备

刘原1，杨华1，吴亮1，苏丹华1，付涛1，郭雪1，刘曼1，姜旭淦1，陈盛霞1，曹建平2

（1.江苏大学医学院，江苏镇江212013；2.中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，上海200025）

目的：克隆刚地弓形虫RH株速殖子棒状体蛋白（rhoptry protein，ROP）16基因，并构建ROP16基因的原核表达系统，检测和定位ROP16蛋白的表达。方法：以弓形虫RH株速殖子基因组DNA为模板，PCR扩增弓形虫ROP16基因，克隆至pET-32a（+）载体，在大肠埃希菌Rosetta中诱导表达。经KCl染色切胶法纯化重组ROP16蛋白，并制备其兔多克隆抗体。采用蛋白质印迹法和间接免疫荧光法检测和定位ROP16在弓形虫速殖子内的表达。结果：成功表达并纯化重组ROP16蛋白，制备了其多克隆抗体。蛋白质印迹法检测出相对分子质量为74 000的特异性条带，间接免疫荧光实验显示ROP16分布于弓形虫速殖子胞质内。结论：经原核表达重组ROP16制备的多克隆抗体能检测和定位ROP16在弓形虫速殖子内的表达。

刚地弓形虫；棒状体蛋白16；原核表达；KCl染色切胶

刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是专性细胞内寄生原虫，几乎可感染包括人类在内的所有恒温动物。弓形虫感染会导致孕妇胎儿畸形、流产、早产甚至死胎。同时，作为一种机会致病寄生虫，它也是引起艾滋病、恶性肿瘤和器官移植等免疫功能严重抑制或缺陷患者死亡的原因之一。弓形虫分泌的棒状体蛋白（rhoptry proteins，ROPs）在其入侵细胞过程中发挥了极其重要的作用。ROPs主要分布于纳虫泡膜、纳虫泡内和宿主细胞内（细胞核和细胞质）［1］，仅有ROP16和蛋白磷酸酯酶2C（PP2C-Hn）被发现可以入侵宿主细胞核。ROP16可通过影响细胞的信号转导和转录激活因子（STAT）信号传导途径，干扰细胞的增殖、分化及凋亡等［2］。此外，ROP16属于ROP2家族成员，是丝氨酸 苏氨酸激酶，并具有蛋白激酶活性［3］，在弓形虫逃避宿主免疫应答中起重要的作用［4］。国内尚未见弓形虫ROP16原核表达的相关报道。本研究通过对弓形虫ROP16进行原核表达，制备其多克隆抗体，检测并定位ROP16在弓形虫速殖子中的表达，为深入研究ROP16的功能及阐明弓形虫的致病机制提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 虫株、细胞株、菌株、载体和动物

刚地弓形虫RH株速殖子由复旦大学医学院病原生物学系徐大刚教授提供，液氮中长期保存。将我室长期保存在液氮中的人包皮成纤维（HFF）细胞培养于含15%胎牛血清DMEM培养液中，用0.25%胰酶消化传代培养于37℃、5%CO2细胞培养箱中。原核表达载体pET-32a（+）及大肠埃希菌（E.coil）DH5α株和Rosetta（DE3）株为本室保存。pTG19-T载体购自上海捷瑞生物工程有限公司。雄性新西兰兔，约2.0 kg，购自江苏大学动物实验中心，清洁级环境下饲养。

1.2 主要试剂和仪器

限制性内切酶Eco RⅠ、Xho I和蛋白质分子质量标准品（立陶宛Fermentas公司）；质粒小量制备试剂盒（离心柱型）、GenClean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（离心柱型）、2×PCR预混液、牛血清白蛋白购自上海捷瑞生物工程有限公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；DMEM培养液购自美国Thermo Fisher（中国）有限公司；FITC标记羊抗兔IgG（FITCIgG）、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG（HRP-IgG）和硝酸纤维素膜购自武汉博士德公司；弗氏完全佐剂和不完全佐剂（美国Sigma公司）；增强型ECL化学发光检测试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司。全自动凝胶成像仪及垂直电泳仪（美国Bio-Rad公司），激光共聚焦显微镜（德国莱卡公司）。

1.3 DNA的提取

参照文献［5］的方法体外培养弓形虫速殖子于HFF细胞中，镜下观察到虫体胀破80%～90%细胞，并可见虫体游离于细胞外时，收集虫体。按试剂盒操作说明提取弓形虫速殖子基因组DNA，-20℃保存备用。

1.4 目的基因扩增

根据基因库中显示的弓形虫RH株速殖子基因组ROP16的基因序列（登录号GQ249080.1），利用DNAStar引物设计软件设计引物。上游引物ROP16-F：5′-GGCGAATTCATGAAAGTGACCACGAAAGGGCTT-3′（下划线为EcoRⅠ酶切部分），下游引物ROP16-R：5′-GGCCTCGAGCATCCGATGTGAAGAAAGTTCGGTAG-3′（下划线为Xho I酶切部分），由上海捷瑞生物工程有限公司合成。以速殖子基因组DNA为模板，扩增弓形虫ROP16编码基因。PCR反应体系：PCRGreen Mix 25μL，上游引物和下游引物各2μL，模板DNA 4μL，灭菌蒸馏水17μL，总体积为50μL。反应条件：94℃10 s（热启动）；94℃5 s，56.8℃60 s，72℃2 min，共25个循环；72℃延伸10 min。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定，用GenClean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物并纯化。

1.5 ROP16/pET32a表达载体的构建

将目的基因片段与载体pTG19-T连接，构建pTG19-T-ROP16载体。将pTG19-T-ROP16转化DH5α感受态细胞，经氨苄西林筛选、PCR扩增及BamHⅠ酶切鉴定，测序分析阳性克隆。将测序正确的阳性重组质粒以限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ酶切回收ROP16基因片段，通过T4连接酶与pET32a连接，构建pET32a-ROP16表达载体，转化DH5α感受态细胞，经过氨苄西林筛选及酶切鉴定阳性克隆。

1.6 重组ROP16在Rosetta菌中的诱导表达

将重组ROP16阳性克隆质粒导入Rosetta感受态菌中。取培养12 h的阳性克隆菌液200μL，按1∶100比例加入含氨苄西林的20 mL LB培养基中。当光密度值［D（600 nm）］达到0.6左右，将上述菌液加入终浓度为0.4 mmol/L的IPTG进行诱导表达，分别于2，4，6，8，10 h收集菌体，取5μL离心后样本上清液进行SDS-PAGE分离，并根据电泳结果确定最佳诱导条件。

1.7 重组ROP16蛋白的纯化

按最佳诱导条件诱导表达，收集菌体沉淀，加入PBS并重悬混匀，取冰上超声裂解后上清液和沉淀进行SDS-PAGE电泳分离，电泳结果显示目的蛋白在包涵体中。故在剩余菌体沉淀中，按每100 mL菌液加入4mL包涵体结合缓冲液，超声裂解后取上清液，采用Ni-NTA亲和纯化柱纯化蛋白，SDS-PAGE电泳发现无目的条带，蛋白未能纯化。故采用KCl染色切胶法纯化目的蛋白［6］。大量表达重组蛋白ROP16，收集菌体沉淀并用包涵体洗涤缓冲液充分洗涤除去杂蛋白，经包涵体结合缓冲液变性、超声裂解等处理后得到上清液，SDS-PAGE电泳后，用1 mol/L预冷的KCl溶液染色5 min，对照考马斯亮蓝染色的蛋白标准分子质量，可见1条明显的目的条带。将目的蛋白条带切下，置于EP管中，-70℃保存。

1.8 重组ROP16蛋白多克隆抗体制备

取出-70℃保存的胶条，每根胶条加1mL弗氏佐剂研磨至肉眼无可见颗粒为止，于背部皮下注射免疫新西兰兔，首次免疫使用弗氏完全佐剂研磨，分别于初次免疫后第21天、28天和35天使用弗氏不完全佐剂研磨胶条并加强免疫新西兰兔。于最后一次免疫前抽取兔耳缘静脉血，当ELISA法检测的血清抗体效价＞1∶51 200时，终止免疫，心脏采血，4 000 r/ min离心20 min，将血清保存于-20℃备用。

1.9 蛋白质印迹法检测ROP16的表达

将弓形虫RH株培养于生长状态良好的HFF细胞中，镜下观察虫体胀破80%～90%细胞，并可见虫体游离于细胞外时，收集虫体，以HFF细胞作为阴性对照。用10μL 1×SDS-PAGE上样缓冲液将虫体及细胞沉淀重悬，煮沸5 min，4℃、16 400 r/ min离心10 min。取上清液5μL加样进行SDSPAGE电泳，将目的蛋白于150 mA、80 min条件下转印到NC膜上，用5%脱脂奶粉封闭30 min，将制备的多克隆抗体（1∶200）作为一抗，室温孵育2 h，TBST缓冲液洗涤3次；将HRP标记的羊抗兔IgG（1∶5 000）作为二抗，室温孵育1 h，TBST缓冲液洗涤3次后加入ECL显色，观察结果。

1.10 间接免疫荧光法（IFA）检测ROP16的分布

无菌条件下于6孔细胞培养板每孔中间放置1个盖玻片，加入适量含15%胎牛血清DMEM培养液，2.5×105个/孔接种HFF细胞。细胞生长至90%左右时，1×106个/孔接种弓形虫RH株，轻摇混匀后置于37℃、5%CO2的培养箱中继续培养。24 h后移除培养液，加入2 mL 4%低聚甲醛室温固定10 min，吸去低聚甲醛后加入2 mL 0.25%TritonX-100透化10 min，5%BSA室温封闭2 h。滴加兔抗重组ROP16蛋白抗血清（1∶200）室温孵育1 h，用PBS缓冲液洗涤3次；滴加FITC-IgG（1∶50）室温孵育1 h，PBS缓冲液洗涤3次；取2μL DAPI至3 mL PBS缓冲液中，染色10 min后再用PBS缓冲液洗涤3次；封片后激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光在虫体内的分布。

2 结果

2.1 弓形虫ROP16基因的PCR扩增

以弓形虫基因组DNA为模板，经PCR扩增后进行0.8%琼脂糖凝胶电泳，获得2 121 bp片段（图1），与弓形虫ROP16理论长度相符。

图1 PCR扩增弓形虫ROP16基因

2.2 ROP16/pET32a重组质粒的鉴定

将ROP16/pET32a重组质粒进行Eco RⅠ和XhoⅠ双酶切，得到大小约为5 422 bp和2 121 bp的两条片段（图2），与预期结果相符，说明ROP16被完整插入到pET32a（+）载体中。

图2 ROP16/pET32a（+）重组质粒Eco RⅠ和XhoⅠ双酶切结果

2.3 重组蛋白的鉴定与纯化

诱导表达产物经SDS-PAGE电泳，结果显示在相对分子质量99 800处出现1条蛋白表达条带（图3），与重组质粒理论蛋白分子质量相符。将KCl染色切胶法纯化获得的胶条与PBS混合，研磨至没有颗粒，取上清液进行SDS-PAGE电泳，可见纯化的蛋白回收条带（图3）。

图3 弓形虫ROP16重组蛋白的表达与纯化

2.4 弓形虫ROP16蛋白的表达

蛋白质印迹检测结果显示，相对分子质量为74 000的条带可被兔抗重组ROP16蛋白多克隆抗血清识别（图4），与重组ROP16蛋白相对分子质量大小相符。由此可以证明KCl染色切胶纯化法制备的兔抗多克隆抗体具有较高的免疫反应活性。

图4 蛋白质印迹法检测弓形虫ROP16蛋白的表达

2.5 IFA检测弓形虫ROP16的表达

激光共聚焦显微镜下可见ROP16蛋白的绿色荧光分布于弓形虫速殖子胞质内，位于细胞核前端，与棒状体位置相符（图5）。

图5 弓形虫ROP16蛋白的分布（IFA×1 000）

3 讨论

棒状体是仅在顶复门寄生虫中发现的一种专性分泌器官，其分泌的蛋白直接进入宿主细胞，发挥各自的功能。弓形虫棒状体分泌的蛋白改变宿主细胞的很多正常生理功能，从而感染大范围的宿主物种和细胞种类［7］。目前已鉴定出9种棒状体蛋白［8］，而唯一能入侵宿主细胞核的只有ROP16。不同弓形虫虫株间ROP16基因序列呈多态性［9］，ROP16因其特殊的功能和在宿主细胞内的定位，成为宿主和弓形虫之间相互作用的关键因子［10-11］。

本研究采用聚合酶链反应、黏性末端双酶切、体外定向克隆、转化感受态细胞、筛选鉴定、蛋白免疫印迹、间接免疫荧光等方法，对ROP16进行原核表达，成功制备了重组ROP16兔多克隆抗体，并检测到ROP16在弓形虫RH株速殖子中的表达和分布，为后续研究ROP16的生物学功能及其在弓形虫致病中的作用提供了技术支持。

目的蛋白在大肠埃希菌中的表达形式分为两种：一是非可溶性的包涵体颗粒，二是可溶性的蛋白质。本研究中ROP16/pET32a（+）重组蛋白以包涵体形式存在，未能用Ni-NTA亲和纯化法获得目的蛋白，原因可能是拟表达的重组蛋白相对分子质量较大或空间结构较为复杂，其His标签可能会被包裹在蛋白内，无法与镍柱结合，难以通过镍螯合层析法纯化［12］。于是我们采用染色切胶法获取目的蛋白，该方法首先要选取一个合适的染料，不仅能将目的蛋白短时间内显现出来，而且还不能破坏其结构。通常采用的考马斯亮蓝R-250染色方法会使蛋白质的一级结构受到影响［13］，于在江等［14］用NaAc染色切胶的方法成功纯化了目的蛋白，但因电泳、染色等过程耗时较长，使用受到限制。与NaAc染色切胶法相比，KCl染色切胶法具有如下优点：①更加高效，获取的目的蛋白可反复冻融，且不会导致浓度和纯度的改变；②试剂成本低，性价比高［15］。

本研究采用IFA技术，以重组ROP16蛋白制备的多抗，在弓形虫速殖子入侵的宿主细胞核内未能检测出ROP16的分布，与已有的研究报道不一致［11，16］，可能是制备的多抗特异性没有单抗强。下一步我们将构建带有Myc标签的ROP16突变株，用Myc单抗来检测ROP16蛋白在宿主细胞核内的分布。

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Prokaryotic expression and polyclonal antibody preparation of rhoptry protein 16 from Toxoplasma gondii

LIU Yuan1，YANG Hua1，WU Liang1，SU Dan-hua1，FU Tao1，GUO Xue1，LIU Man1，JIANG Xu-gan1，CHEN Sheng-xia1，CAO Jian-pin2
（1.School ofMedicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013；2.National Institute of Parasitic Diseases，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Shanghai200025，China）

Objective：To clone and construct a recombinant expression plasmid of rhoptry protein（ROP）16 from tachyzoites of Toxoplasma gondii（T.gondii）RH strain in Escherichia coli，and to determine and locate the expression of ROP 16 in tachyzoites.M ethods：The ROP16 gene was amplified from genomic DNA of T.gondii RH strain and cloned into the plasmid pET-32a（+）.The expression of the recombinant pET32a-ROP16 was induced in E.coli Rosetta strain，and ROP16 was purified by cutting the gel sliceswith KCl stain.The anti-ROP16 polyclonal antibody was produced in rabbit，and ROP16 in tachyzoiteswas analyzed by Western blotting and indirect immunofluorescence assay（IFA）respectively.Results：The recombinant plasmid pET32a-ROP16 was successfully expressed and purified，and the anti-ROP16 polyclonal antibody was obtained.The 74 000 specific band of ROP16 was detected by Western blotting，and the ROP16 was distributed in the cytoplasm of tachyzoites by IFA.Conclusion：The anti-ROP16 polyclonal antibody prepared by recombinant ROP16 can detectand locate the expression of ROP16 in tachyzoites of T.gondii.

Toxoplasma gondii；ROP16；prokaryotic expression；KCl stain

R382.5 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 1671-7783（2015）03-0251-05

10.13312/j.issn.1671-7783.y140296

国家自然科学基金资助项目（81301453）；卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室开放课题（WSBKTKT201302）；中国博士后科学基金资助项目（2014M561598）；江苏省博士后科研资助计划项目（1402171C）；江苏大学高级人才启动基金资助项目（13JDG023，13JDG127）

刘原（1991—），女，硕士研究生；陈盛霞（通讯作者），教授，博士生导师，E-mail：chensxia@ujs.edu.cn

2014-11-15 ［编辑］陈海林