大鼠骨髓间质干细胞来源的外切体抑制顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡

祝源，杨芳，张娇，薛建国，尹磊，俞静，贾浩源，纪成，钱晖

（江苏大学医学院，江苏镇江212013）

大鼠骨髓间质干细胞来源的外切体抑制顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡

祝源，杨芳，张娇，薛建国，尹磊，俞静，贾浩源，纪成，钱晖

（江苏大学医学院，江苏镇江212013）

目的：观察大鼠骨髓间质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）来源的外切体（exosome）对顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡的影响。方法：原代培养大鼠骨髓MSC并提取外切体鉴定。构建顺铂损伤NRK-52E细胞模型，损伤组为5μmol/L顺铂处理6 h后正常营养液培养48 h，处理组为顺铂损伤后以100μg/mL外切体共培养48 h。未经任何处理的NRK-52E细胞为对照组。TUNEL-FITC，凋亡双染流式细胞术，蛋白质免疫印迹技术检测各组细胞凋亡情况。结果：与对照组比较，损伤组NRK-52E细胞肿大，胞核不规则样改变，凋亡细胞增多，凋亡相关蛋白Bax上调而Bcl-2下调；处理组NRK-52E细胞肿大较损伤组缓解，胞核形态改善，凋亡细胞减少，Bax下调且Bcl-2上调。结论：大鼠骨髓MSC来源的外切体对顺铂诱导的NRK-52E细胞凋亡有一定的抑制作用。

外切体；顺铂；肾小管上皮细胞；损伤；凋亡

间质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）是干细胞疗法中重要的种子细胞，在肾损伤修复中有较好的应用前景［1］，研究证实其旁分泌的因子，如内皮生长因子在MSC损伤修复中起重要作用［2］。近年来，MSC分泌的外切体作为旁分泌中最有活性的成分以及细胞间信息传递的重要载体，已成为组织再生修复的新热点［3］。本课题组前期研究也表明，人脐带MSC来源的外切体（hucMSC-ex）对顺铂诱导的急性肾损伤有治疗作用［4］，且对深Ⅱ度皮肤烧伤和CCl4诱导的肝纤维化也有修复效果［5-6］。在此基础上，本研究拟分离纯化大鼠骨髓MSC来源的外切体，并观察其对顺铂诱导的大鼠近端肾小管上皮细胞损伤的保护作用，以期为MSC来源外切体的深入研究提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E（中国科学院典藏培养物保藏委员会细胞库）；顺铂（中国德州制药有限公司），胎牛血清、H-DMEM（Invitrogen公司），TUNEL-FITC试剂盒（Vazyme公司），DAPI染料（Beyotime公司），Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒（Invitrogen公司），外切体提取试剂盒（System Biosciences公司，货号EXOQ5A-1），兔抗鼠Bax、Bcl-2（Bioworld公司），抗GAPDH鼠单克隆抗体，辣根过氧化物酶（HRP）标志的羊抗鼠IgG抗体、羊抗兔IgG抗体（Cwbio公司），预混HRP化学发光底物（Millipore公司）；Forma CO2培养箱（Scientific公司），Ti-S荧光倒置显微镜（日本Nikon公司），超净工作台（苏州净化设备厂），LM10-HBST纳米颗粒分析仪［NanoSight（NTA）公司］，FACSCalibur流式细胞仪（BD公司），ImageQuantLAS4000mini凝胶成像分析仪（GE公司）。

1.2 方法

1.2.1 外切体的分离鉴定 选取健康4周龄SD雄鼠，无菌环境下以PBS盥洗股骨骨髓腔，腔液经离心后重悬于营养液中贴壁培养。传至第4代进行干细胞鉴定［7］并收集培养上清，按照说明书分离上清中的外切体，利用纳米颗粒分析仪及蛋白质印迹进行鉴定。

1.2.2 顺铂损伤细胞模型构建及外切体共培养用含5%胎牛血清的H-DMEM培养NRK-52E细胞，于37℃、5%CO2培养箱中常规培养。经胰蛋白酶消化后，以每孔7×104个细胞于6孔板中继续贴壁培养。实验分3组进行，对照组：NRK-52E细胞不经任何处理；损伤组：NRK-52E细胞经5μmol/L顺铂处理6 h后，换常规培养基继续培养48 h；处理组：5μmol/L顺铂刺激NRK-52E细胞6 h后，换含有100μg/mL外切体的常规培养基继续培养48 h。

1.2.3 TUNEL-FITC检测各组细胞的凋亡 用4%低聚甲醛溶液固定各组NRK-52E细胞，然后按照说明书操作，PBS清洗，2%Triton X-100室温孵育5 min，PBS清洗，1×平衡缓冲液室温孵育30 min，再用TdT孵育缓冲液37℃避光孵育60 min。PBS洗涤后，DAPI避光染色5 min，荧光倒置显微镜观察结果。

1.2.4 双染流式细胞术检测细胞凋亡 胰蛋白酶消化、收集各组NRK-52E细胞，冰PBS洗涤1次，100μL 1×Annexin结合缓冲液重悬，加入5μL Alexa Fluor 488 Annexin V和1μL 100μg/mL PI试剂室温孵育15 min，加入400μL 1×Annexin结合缓冲液，轻混后置于冰上，避光，上流式细胞仪，设定的激发光波长分别为530 nm和575 nm。

1.2.5 蛋白质印迹法检测Bax、Bcl-2蛋白的表达

收集各组NRK-52E细胞，离心后加入细胞裂解液充分裂解，按照4∶1的体积加入5×上样缓冲液，沸水煮10 min。等量蛋白进行SDS-PAGE，转移所有蛋白至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭，以Bax（1∶500）、Bcl-2（1∶500）和GAPDH（1∶5 000）抗体稀释液4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，HRP标记的抗鼠/兔（1∶5 000）抗体稀释液37℃孵育1 h，TBST洗膜3次，配置预混HRP化学发光底物进行凝胶成像分析。GAPDH作为内参照。

1.3 统计学分析

实验数据用Prism 5.0软件进行直方图绘制及统计学分析，多组均数间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外切体分离与鉴定

分离的大鼠骨髓MSC来源的外切体经纳米分析仪检测，结果显示，获得的颗粒直径平均值为91 nm，众数为68 nm，D10为46 nm，D50为78 nm，D90为149 nm，证实为外切体（图1）。

2.2 细胞形态学观察

对照组常规培养的NRK-52E细胞的形态为鹅卵石典型上皮样细胞，而损伤组NRK-52E细胞在镜下可见细胞明显肿大，胞质内颗粒增多，出现大小不一空泡，细胞数量较对照组明显减少，但处理组细胞肿大现象有所改善，细胞数量较损伤组增多（图2）。

图1 大鼠骨髓MSC来源的外切体鉴定

2.3 TUNEL-FITC检测细胞凋亡

荧光倒置显微镜观察结果显示，与对照组比较，损伤组凋亡细胞明显增加，细胞核呈不规则样改变，表明顺铂促进细胞凋亡；处理组凋亡细胞较损伤组减少，同时细胞核形态相对规则，提示外切体削弱了顺铂的促凋亡作用。见图3。

2.4 流式细胞术分析细胞凋亡

结果显示，与对照组比较，损伤组发生晚期凋亡的细胞比例明显增高，而处理组则较损伤组明显降低（P＜0.001）；处理组早期凋亡细胞比例较对照组和损伤组明显降低（P均＜0.001）。由此可见，顺铂能诱导NRK-52E细胞凋亡，且以早期凋亡为主，而外切体处理后，细胞凋亡明显减少，尤以早期凋亡明显（图4）。

图2 各组细胞的形态（×200）

图3 TUNEL-FITC检测各组细胞的凋亡（×200）

图4 细胞凋亡的流式细胞术检测结果

2.5 各组细胞Bax、Bcl-2蛋白的表达

结果表明，损伤组NRK-52E细胞凋亡相关蛋白Bax表达较对照组明显增加，而Bcl-2表达明显减少。处理组Bax表达较损伤组下降，而Bcl-2表达增加，定量分析结果与其一致（图5）。

3 讨论

外切体是一种膜型囊泡样结构，能够运载多种蛋白质、RNA等具有生物活性成分的物质从而完成细胞间信号传递［8］。研究表明，完整的MSC来源的外切体可以通过增加ATP含量，减少氧化应激，活化PI3K/Akt信号通路，恢复小鼠缺血再灌注后心肌的生物学功能［9］。也有研究显示人的MSC来源的微囊泡可有效修复大肠埃希菌内毒素诱导的急性肺损伤，一定程度上是由于微囊泡携带角质细胞生长因子的mRNA至受损肺泡所致［10］。

图5 蛋白质印迹检测Bax、Bcl-2蛋白表达

本实验室前期研究结果发现人脐带MSC来源的外切体（hucMSC-ex）通过抑制由顺铂诱导的p38-MAPK通路活化而促进的细胞凋亡，从而减弱顺铂诱导的大鼠急性肾氧化损伤［4］。另外，hucMSC-ex通过携带Wnt4分子，活化烫伤组织中β-catenin信号通路，从而促进深Ⅱ度烧伤的修复［5］。在CCl4诱导的小鼠肝纤维化中，hucMSC-ex通过抑制肝脏细胞上皮-间质表型转换（EMT）改变，减少Ⅰ型和Ⅲ型胶原以及TGF-1β和p-Smad2的表达，以达到减轻纤维化并保护肝脏的作用［6］。大鼠骨髓MSC来源丰富，培养相对便捷；MSC对组织器官损伤的修复作用是通过分泌的外切体完成的。因此，本实验采用大鼠骨髓MSC来源的外切体对顺铂诱导的大鼠的肾小管上皮细胞损伤进行修复，并探讨其机制。

本研究鉴定并确认了提取的大鼠骨髓MSC来源外切体。在此基础上成功建立了顺铂诱导大鼠肾小管上皮细胞急性损伤模型，并初步证明，提取的外切体在一定程度上能减弱顺铂诱导的NRK-52E细胞凋亡。顺铂刺激引起的肾小管上皮细胞肿大及细胞核形态不规则样改变等情况，在与外切体共培养后有明显改善，同时凋亡细胞也减少。顺铂诱导的NRK-52E细胞内凋亡相关蛋白Bax上调而Bcl-2下调的现象也在外切体处理后发生逆转。本研究说明，外切体在削弱顺铂诱导细胞凋亡的过程中，主要是通过减少早期凋亡细胞完成的，但是外切体抑制细胞早期凋亡的机制及相关通路有待阐明。

研究表明，外切体中的miRNAs协同作用可缓解缺氧引起的心肌损伤［11］，而且药物改造后的外切体能更好地发挥药效［12］。已有报道称miRNAs与细胞的增殖凋亡密切相关，这些研究结果将为我们下一步研究提供依据和启发。

综上所述，本研究表明，大鼠骨髓MSC来源的外切体能减弱顺铂诱导的NRK-52E细胞急性损伤，进一步减少肾小管上皮细胞凋亡，尤其是早期凋亡。

［1］ Tögel FE，Westenfelder C.Mesenchymal stem cells：a new therapeutic tool for AKI［J］.Nat Rev Nephrol，2010，6（3）：179-183.

［2］ Li D，Wang N，Zhang L，etal.Mesenchymal stem cells protect podocytes from apoptosis induced by high glucose via secretion of epithelial growth factor［J］.Stem Cell Res Ther，2013，4（5）：103.

［3］ Camussi G，Deregibus MC，Bruno S，et al.Exosomes/ microvesicles as amechanism of cell-to-cell communication［J］.Kidney Int，2010，78（9）：838-848.

［4］ Zhou Y，Xu H，XuW，etal.Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro［J］.Stem Cell Res Ther，2013，4（2）：34.

［5］ Zhang B，Wang M，Gong A，et al.hucMSC-exosome mediated-Wnt4 signaling is required for cutaneous wound healing［J］.Stem Cells，2014.［Epub ahead of print］.

［6］ Li T，Yan Y，Wang B，et al.Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate liver fibrosis［J］.Stem Cells Dev，2013，22（6）：845-854.

［7］ 孙晓春，姚堃，许文荣，等.大鼠骨髓间质干细胞体外分离培养及生物学特性研究［J］.江苏大学学报：医学版，2003，13（4）：289-291.

［8］ Février B，Raposo G.Exosomes：endosomal-derived vesicles shipping extracellularmessages［J］.Curr Opin Cell Biol，2004，16（4）：415-421.

［9］ Arslan F，Lai RC，Smeets MB，et al.Mesenchymal stem cell-derived exosomes increase ATP levels，decrease oxidative stress and activate PI3K/Akt pathway to enhancemyocardial viability and prevent adverse remodeling after myocardial ischemia/reperfusion injury［J］.Stem Cell Res，2013，10（3）：301-312.

［10］ Zhu YG，Feng XM，Abbott J，et al.Human mesenchymal stem cell microvesicles for treatment of Escherichia coli endotoxin-induced acute lung injury in mice［J］.Stem Cells，2014，32（1）：116-125.

［11］ Gray WD，French KM，Ghosh-Choudhary S，et al.I-dentification of therapeutic covariantmicroRNA clusters in hypoxia-treated cardiac progenitor cell exosomes using systems biology［J］.Circ Res，2015，116（2）：255-263.

［12］ Sun D，Zhuang X，Xiang X，et al.A novel nanoparticle drug delivery system：the anti-inflammatory activity of curcumin is enhanced when encapsulated in exosomes［J］.Mol Ther，2010，18（9）：1606-1614.

Exosome derived from rat bonemarrow mesenchymal stem cells inhibits the apoptosis in cisplatin-induced renal proximal tubular epithelial cells

ZHU Yuan，YANG Fang，ZHANG Jiao，XUE Jian-guo，YIN Lei，YU Jing，JIAHao-yuan，JICheng，QIAN Hui
（School of Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To investigate the effect of exosome derived from rat bonemarrow mesenchymal stem cells on the apoptosis of cisplatin-induced renal proximal tubular epithelial cells.M ethods：Primitive rat bonemarrow mesenchymal stem cellswere separated and cultured in vitro from which exosome were extracted and proofed.The injury of NRK-52E cellswas induced by 5μmol/L cisplatin for 6 h and cultured for another 48 h using normal DMEM.100μg/mL exosome contained DMEM was used in restoration group for the 48 h after the cisplatin treatment，and normal NRK-52E cells with no treatment were used as control.TUNEL-FITC，flow cytometry and immunoblotting were used to detect the apoptosis in each group.Results：Compared with the control group，NRK-52E cells in cisplatin group grew into swollen ones with nucleus changed irregularly，the number of apoptotic cellswas increased；the expression of apoptosis associated protein Bax was upregulated while Bcl-2 downregulated.However，in the exosome group，the phenomenon of swell and irregular nucleus in NRK-52E cellswas alleviated.The number of apoptotic cellswas decreased，with decreased expression of Bax and increased expression of Bcl-2.ConclusionExosome derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells could suppress the apoptosis induced by cisplatin in NRK-52E cells.

exosome；cisplatin；renal proximal tubular epithelial cell；injury；apoptosis

祝源（1990—），女，硕士研究生；钱晖（通讯作者），教授，博士生导师，E-mail：lstmmmlst@163.com

R329.25 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 1671-7783（2015）03-0203-04

10.13312/j.issn.1671-7783.y150047

国家自然科学基金资助项目（81272481）；江苏高校优秀科技创新团队资助项目［苏教科（2013）10号］；江苏省医学领军人才与创新团队项目（LJ201117）；江苏省高等学校大学生创新创业训练计划项目（201310299058Y）

2015-03-17 ［编辑］ 刘星星