低温几丁质酶chiA基因克隆、同源建模及序列分析

王晓辉，曹洪玉，张庆芳，迟乃玉

（大连大学 生命科学与技术学院，辽宁 大连 116622）

低温几丁质酶chiA基因克隆、同源建模及序列分析

王晓辉，曹洪玉，张庆芳，迟乃玉

（大连大学 生命科学与技术学院，辽宁 大连 116622）

从假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp. DL-6）中克隆低温几丁质酶chiA基因（GenBank登录号KF234015）。该序列全长3160个核苷酸，编码1053个氨基酸，预测相对分子质量113.5 KDa，等电点（pI）4.49，命名为chiA。功能结构域分析显示其编码区包含信号肽、2个几丁质结合域、2个成人多囊肾病结构域、18家族几丁质酶催化域与18家族糖苷水解酶C端部分序列。利用Discovery Studio平台以同源建模的方法构建低温几丁质酶chiA的催化域三维结构模型，并对其进行结构优化和评估，Ramachandram图谱检测和Verify-3D评估显示模拟出的模型结构合理，整体的相容性较为可信。本结果拟为后期低温几丁质酶chiA的催化机理研究提供理论依据。

低温几丁质酶chiA；假交替单胞菌；同源模建；序列分析

几丁质是海洋环境含量最丰富的可再生资源，据估测，海洋环境每年超过1011吨几丁质形成，其降解主要是通过产几丁质酶的微生物完成[1]。酶法降解主要通过内切酶随机切割多糖链，外切酶沿糖链末端降解，整个水解过程是通过糖苷水解酶系来完成的[2]。酶法高效降解具有反应条件温和，无污染，降解过程易控制等优点，是国内外利用可再生资源的发展方向[3]。几丁质酶(chitinase, chi, EC3.2.1.14)降解几丁质生产的几丁寡糖、几丁单糖及其衍生物由于具有良好的组织兼容性和生物降解性以及调节免疫力和抗癌的保健功能等特点，在医药、食品、农业、工业等领域有着广泛的应用前景[4,5]。

近年来，随着基因工程技术的不断发展，低温几丁质酶的研究重点逐步转向酶基因的克隆表达及功能研究。截至目前，仅有10多种低温几丁质酶基因被克隆、测序及性质表征，仅解析1种低温几丁质酶的结晶结构，以及1种低温几丁质酶的催化域[6]，分别为来源于菌株Moritella marina的MmChi60和南极菌Arthrobacter sp. TAD20几丁质酶chiB的催化域。低温几丁质酶的结构解析对于深入探讨低温酶的反应机制、底物结合和催化效率等有重要意义。蛋白结构测定主要是依靠NMR技术和X射线晶体衍射，但方法复杂、价格昂贵，无法大规模测定蛋白质信息，故以计算机技术为基础的同源建模在蛋白质结构的研究中发挥重要作用。同源建模[7]是从蛋白的氨基酸序列出发，即在序列一致性大于30%的前提下，可以利用一个或多个相似蛋白的结构信息来模拟建立未知结构蛋白质的三维结构。因此，相似蛋白之间一级序列的一致性越高，模建出来的三维结构的准确性越高。利用同源建模技术模拟蛋白质的三维结构，深入探讨结构信息进而可深入了解蛋白质的功能。

假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)是海洋环境产几丁质酶系的代表性微生物，Tsujibo等[8-10]报道该属分泌几丁质降解系统至少包括 4种几丁质酶，3种N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，1种糖基转移酶，1种几丁质结合蛋白和1种蛋白酶，协同降解几丁质，应用潜力巨大。但国外已报道的野生菌生产几丁质酶活力较低，国内未见该菌属生产几丁质酶功能研究的相关报道。本文从海洋底泥样品中筛选到高产几丁质酶的交替假单胞菌，命名为 Pseudoalteromonas sp. DL-6(Genebank登录号KF208362)，从该菌株克隆了低温chiA基因，对其进行生物信息学分析，并使用同源建模技术模拟该蛋白催化域的三维结构，为进一步催化机理的研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒

假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp. DL-6)筛选自中国辽宁大连渤海海域近海底泥6～100 m（123。371，E，39。6972，N）；E.coli DH5α 菌株由实验室保存；质粒pMD™19-T Vector Cloning Kit购自宝生物工程（大连）有限公司；引物合成和基因测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 培养基

LB培养基（1000 mL）：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，pH 7.0；LB固体培养基需向液体培养基内加入 2%（w/v）琼脂。LA培养基：LB液体或固体培养基中加入终浓度为 100 μg/mL氨苄青霉素。

1.3 低温几丁质酶chiA基因的克隆

按细菌基因组DNA提取试剂盒操作步骤提取菌株Pseudoalteromonas sp. DL-6的基因组DNA。以基因组DNA为模板，根据NCBI同源序列设计简并引物 ， 正 义 引 物 (5‘-ATGAGCTCACGKAAAATAA TAAMAAATGCC-3‘)， 反 义 引 物 (5‘-TTACAGGC TACAACTTAARSTCCAATC-3‘)，使用 TaKara LA Taq酶扩增得到低温chiA的DNA序列；将该序列连接到pMDl9-T载体，构建pMDl9-T-chiA质粒转化至E. coli DH5α，得到阳性转化子。再通过 TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification试剂盒提取重组质粒，以 pMD19-T载体上的测序引物 BcaBEST Primer M13-47和BcaBEST Primer RV-M测定重组质粒的核苷酸序列。

1.4 低温几丁质酶chiA基因序列的生物信息学分析

序列的同源分析通过 NCBI(National Center for Biotechnology Information，http∶//www.ncbi.nlm.nih.gov/)上的 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST，http∶//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)完成。采用在线的 Simple Modular Architecture Research Tool(SMART，http∶//smart.embl-heidelberg.de/)进行序列结构域分析。采用Discovery Studio分子模拟软件进行同源模建。

1.5 低温chiA的同源模建

1.5.1 模板蛋白的序列搜索

利用 Discovery Studio中的 BLAST Search(DS Server)模块，将 chiA的氨基酸序列导入模块搜索PDB结构数据库，搜索可以作为chiA同源建模模板的蛋白。根据搜索结果，得到与目标蛋白同源性最高的晶体结构1ITX。因此本文选取1ITX作为模板，采用同源模建的方法，构建目标蛋白的空间结构。

1.5.2 模板蛋白与目标蛋白进行序列比对

利用Discovery Studio的Align Multiple Sequences模块进行目标序列与模板序列的多重序列比对，设置新开空位罚分 10，延续空位罚分 0.05，采用BLOSUM参数矩阵进行多重序列比对运算[11]。

1.5.3 基于目标序列与模板多重序列比对的同源模型的构建

利用 Discovery Studio平台的 Build Homology Models模块进行多模板序列对目标序列的同源建模，载入多重序列比对结果，打开1ITX模板的PDB文件，参数设置中，Number of Models设置为10，表示同源建模的个数为10个。Optimization Level设置为 High，表示构建模型的效果选择最佳，这一步会造成建模时间的增加，总的建模时间2小时56分钟。

1.5.4 对目标蛋白进行评价

通过Ramachandran plot和Profile-3D两种方法进行模型的评价。

Ramachandran plot方法是用于阐述蛋白质或肽立体结构中肽键内 α碳原子和羰基碳原子间的键的旋转度对α碳原子和氮原子间的键的旋转度，主要用来认识蛋白质或肽类中氨基酸的允许和不允许的构象。Profile-3D方法采用3D-1D的打分函数来检测所构建模型与自身氨基酸序列的匹配度关系。分数越高，说明同源模型的可信度越大。

2 结果与讨论

2.1 低温几丁质酶chiA全长基因的克隆

以Pseudoalteromonas sp. DL-6菌株基因组DNA为模板，利用简并引物chiA-F和chiA-R扩增出目的片段，大小约为3160 bp（图1）。与预计片段大小相近，切胶回收后测序，确定为目的基因的保守片段。

图1 低温几丁质酶chiA基因的电泳检测

2.2 低温几丁质酶chiA基因生物信息学分析

低温chiA全序列进行测序分析可以得出结论为：该序列全长3160个核苷酸，以ATG为起始密码子，TAA为终止密码子。该序列编码1053个氨基酸构成的完整蛋白阅读框，估算其分子相对质量为113.5KDa，pI值为4.49，将该基因命名为chiA，提交NCBI数据库，登录号为KF234015。

chiA氨基酸序列提交 SMART进行保守结构域分析，结果显示见图2，chiA的N端1-27位氨基酸构成信号肽，N端34-79位和C端1012-1053位氨基酸构成类型 3几丁质结合域（type-3 chitin-binding domains，Pfam：PF02839），N 端 102-181位和 194-280位氨基酸构成成人多囊肾病结构域（Polycystic Kidney Disease，PKD），323-786位氨基酸为18家族几丁质酶催化域（GH18 catalytic domain），795-987位氨基酸为18家族糖苷水解酶C端部分序列（Pfam：PF06483）。其中1-27位信号肽的存在表明了假交替单胞菌DL-6分泌表达几丁质酶蛋白途径。

图2 chiA结构图

本研究chiA除催化域外还包含如几丁质结合域、成人多囊肾病结构域等结构，这些结构域的功能已有文献报道，但机制阐述得还不是很清楚[12]。chiA在N端和C端存在两个类型3的几丁质结合域，根据Cazy分类归属于碳水化合物结合模块 CBM5或CBM12，但因两个家族的蛋白相近蛋白质家族数据库（Pfam；www.pfam.org）归为一个家族(PF02839)，即CBM_5_12。据报道其对于糖苷键的水解具有非常重要的作用，尤其针对于晶体粉状几丁质[13]，主要是其表面的色氨酸与底物作用结果。几丁质结合域可能更利于几丁质酶正确定位于催化域、持续的作用模式和底物脱乙酰作用等方面[14-17]，但至于该结构如何完成底物的有效降解机理并未完全阐述[15]。通常几丁质酶只具有一个几丁质结合域，但本研究的 chiA具有两个几丁质结合域，而且位于几丁质酶的两端，推测这种特殊的结构更利于chiA低温下与底物紧密结合，低温下高催化效率、增加底物的弹性降解等功能。有趣的是，本研究的chiA还具有两个成人多囊肾病结构域，Orikoshi[18]等人报道Alteromonassp.strain O-7菌株的几丁质酶A的N端也具有成人多囊肾病结构域，该结构域通过两个芳香族氨基酸与底物晶体几丁质的紧密结合而完成高效降解，该结构域不仅能与粉状几丁质结合还可以与纤维素和壳聚糖结合。尽管如此，chiA中的成人多囊肾病结构域是否具有同样功能还需进一步验证。

2.3 低温几丁质酶chiA的同源模建

为了确认chiA催化域保守区段和催化残基，针对催化域利用Discovery Studio软件进行同源模建。

2.3.1 模板蛋白与目标蛋白的序列比对

利用 Discovery Studio中的 BLAST Search(DS Server)模块，将 ChiA的氨基酸序列导入模块搜索PDB结构数据库中，搜索可以作为chiA同源建模模板的蛋白结构。ChiA蛋白全序列比对未发现满足同源模建的序列，只有催化域找到同源性较高的目标蛋白，序列比对结果见图3。chiA与模板蛋白催化域的同源性为 29%，相似性 45%。模板蛋白为来源菌株Bacillus circulansWL-12的几丁质酶 A1的催化域(PDB∶1ITX)满足同源模建。

图3 chiA与目标蛋白催化域的多重序列比对

2.3.2 基于目标序列与模板多重序列比对的同源模型的构建

如表1所示，通过Modeller构建总共10个同源建模模型，软件在模型构建好之后会自动进行能量的打分。

表1 同源建模构建模型的结构能量得分

PDF的函数值可以直接反应出所构建模型的好坏，一般PDF Total Energy越小，表明模型能更好地满足所提取的同源约束条件，模型的可信度也就越大。而 DOPE是一个基于原子统计势能的程序，也主要用于模型评估。它的分数可以认为是衡量同一个分子不同构象可信度的标准，能够帮助选择预测结构的最优模型，分数越低，模型越可靠。结合PDF和DOPE结果我们可以发现，在软件的自动排序中，尾数标号为 B99990002排在第一位，说明这个模型在评分中是最优的。

2.3.3 模型评价与分析

由图4拉曼图谱(Ramachandran Plot)[7]中可以看出蓝色和紫色的区域站的比例挺大的，区域外红色的点的误差是在允许的范围内，这主要是目标蛋白与所有已研究的模板蛋白同源性低的原因所在。

图4 模型结构的Ramachandran plot图谱

由Profile-3D结果可知，多次优化后的模型B99990002的整体结构相容性评分较高，评分值达到183.24，远远高于预期低评分 95.34，故可认为优化后的模型整体的相容性较为可信。

2.3.4 chiA催化域氨基酸序列分析

从图chiA的三维结构模型可见，chiA与其他已解析的18家族几丁质酶拥有相似的三级结构(图5)，即(βα)8的―T IM”结构。中心部分是平行的β折叠组成的内桶，依次为β1～β8，由α螺旋将它们逐个连接起来，外桶由 α1-α8组成，内外桶紧贴在一起。α螺旋与β折叠之间由一段无规卷曲连接起来。在18家族中高度保守的两段氨基酸片段相应于β3和β4链，具有相似的结构。底物结合的部位就在保守序列β3和β4链形成的环状缝中。

图5 菌株DL-6中chiA催化域同源建模结构图

图6 chiA催化域与其他生物体的催化域(序列来源于PDB数据库)多重序列比对

根据chiA催化域同源模建模型，结合DNAMAN软件对chiA编码催化域氨基酸序列与已知晶体结构的几丁质酶催化域的氨基酸序列进行比对分析结果(图6)，研究chiA编码的催化域氨基酸序列的保守氨基酸残基信息，推测chiA催化反应机制。序列比对分析所选序列包括环状芽孢杆菌(Bacillus circulans Wl-12)菌株 Chitinase A1 的 A 链(PDB∶ 1ITX_A)，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)菌株几丁质酶B的A链(PDB 1E15_A)，哈氏弧菌(Vibrio Harveyi)菌株几丁质酶 A 链(PDB∶ 3B8S_A)，粘质沙雷氏菌(S.Marcescens)菌株几丁质酶A的A链(PDB∶ 1EDQ_A)，食线虫真菌粉红粘帚霉几丁质酶Crchi1的A链(PDB∶3G6L_A)，人类壳三糖酶的 A 链(PDB∶ 1GUV_A)，哺乳动物几丁质酶的A链(PDB∶ 3FXY_A)，海洋细菌(Moritella)低温几丁质酶的 A 链(PDB∶ 4HMC_A)。从图6可见，尽管不同物种几丁质酶的功能及编码氨基酸序列差异较大，但其催化域的关键氨基酸是高度保守的。chiA具有18家族糖苷水解酶的两个典型保守模块，分别为99SxGG102和154DxxDxDxE161[19-21]，位于催化域的环状缝部位，两个保守模块在已研究的几丁质酶催化活性中心分别负责酶与底物结合及催化降解底物功能。

18家族几丁质酶催化是通过―底物辅助机制”，从结构与序列比对来看本研究chiA也遵循此底物辅助双取代水解机制，导致异头碳的构象发生改变。154DxxDxDxE161形成即(βα)8桶的β4链，构成催化域的核心部位，其中谷氨酸(Glu，E161)为酶催化反应关键质子供体，催化水解-1亚位和+1亚位之间的糖苷键，而靠近谷氨酸的两个天冬氨酸(Asp，D157和D159)在底物水解过程中也发挥关键作用。而 D159被认为是反应的稳定剂，氨基酸侧链发挥以下作用：保证GlcNAc残基的N乙酰基团正确结合在-1位，亲核攻击异头碳的羰基氧；稳定离子中间体 oxazolinium；降低催化氨基酸谷氨酸的pKa。D157被认为是稳定剂的辅助因子，增加D159的pKa[19,22]。

3 结论与讨论

近年来几丁质酶的研究已经发展到结构与功能分析等方面，但仅依靠试验不能获取几丁质酶全部功能信息，故同源建模技术成为构建几丁质酶空间结构，预测酶功能的重要手段。本文以1ITX为模板，采用多模板同源建模的方法构建了低温几丁质酶chiA催化域的三维结构。Ramachandram 图谱检测和Verify-3D评估显示模拟出的模型结构合理，整体的相容性较为可信。综合序列比对、结构域分析与同源模建结果，表明chiA为糖苷水解酶18家族的一名新成员。根据chiA催化域同源构建模型结合与其他生物体18家族几丁质酶催化域的多重序列比对结果表明，chiA具有 18家族几丁质酶的99SxGG102和154DxxDxDxE161典型模块，推测chiA通过―底物辅助机制”实现酶催化反应。为进一步研究低温几丁质催化结晶状几丁质结构与功能的关系提供了理论依据，同时为低温几丁质酶的进一步改造提供理论基础。

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Cloning, Homology Modeling and Sequecnce Analysis of Cold-Adapted chiA

WANG Xiao-hui, CAO Hong-yu, ZHANG Qing-fang, CHI Nai-yu
（College of Life Science and Technology, Dalian University, Dalian 116622, China）

∶A gene encoding cold-adapted chitinase (GeneBank No.KF234015) was cloned from Pseudoalteromonas sp. DL-6. This complete gene was consisted of 3,160 bp, and encoded a protein of 1,053 amino acids, the predicted molecular mass and pI were 4.49 and 113.5 kD, respectively, named chiA. The analysis of domain indicted that the chiA contained signal, two type-3 chitin-binding domains (ChtBD), two consecutive polycystic kidney disease domains (PKD), a GH18 catalytic domain and partial sequence of chic of GH18. Based on Discovery Studio we built the homology structure and refined the model of catalytic domain of cold-adapted chiA using computer modeling.The diagram of Ramachandram and Verify-3D showed that the model was in accordance with the stereochemistry,and the overall compatibility of this model was credible. The research provided theoretical basis for the further study on catalytic mechanism of cold-adapted chiA.

∶cold-adapted chiA; Pseudoalteromonas sp. DL-6; homology modeling; sequence analysis

Q93/TQ925

A

1008-2395(2015)06-0060-06

2015-03-02

王晓辉（1981-），女，讲师，博士生在读，研究方向：微生物与酶工程。