膨大剂分子印迹电化学传感器的研究

申贵隽，李雅茹，谷灵燕，赵志伟，弓晓杰

（1. 大连大学 环境与化学工程学院，辽宁 大连 116622；2. 大连大学 医学院，辽宁 大连 116622）

膨大剂分子印迹电化学传感器的研究

申贵隽1，李雅茹1，谷灵燕1，赵志伟1，弓晓杰2,*

（1. 大连大学 环境与化学工程学院，辽宁 大连 116622；2. 大连大学 医学院，辽宁 大连 116622）

膨大剂（CPPU）为模板分子，邻苯二胺为功能单体,制备了膨大剂分子印迹传感器。用循环伏安法和差分脉冲伏安法法研究了该电极的选择性和灵敏度。结果表明，该分子印迹电极对膨大剂分子具有良好的催化作用和选择性。在pH为4.8的醋酸及其钠盐的缓冲溶液中，峰电流与膨大剂浓度在0.05 mg/mL～2.0 mg/mL范围内呈良好的线性关系，最低检出限为0.01 mg/mL。所建立的电化学分析方法操作简便，可直接用于西瓜中膨大剂含量的测定。

膨大剂；分子印迹；差分脉冲伏安法；邻苯二胺

0 引言

氯吡脲（Forchlorfenuron，CPPU）俗称膨大剂，是一种激素类化合物。该物质对植物可产生枝干助长、果实速成作用。然而，在种植过程中一旦使用过量就会导致果实外形畸变、品质下降、贮藏期短和烂果等不良后果。至于果蔬中残留的生长激素是否对人体健康产生危害，虽有文献报道但意见不一，仍是当前果蔬种植、加工和安全检测行业亟待探索和验证的热门课题[1]。目前对其检测的报道文献主要有高效液相色谱与质谱联用法[2,3]，固相萃取－高效液相色谱联用法[4]、分散萃取－反相高效液相色谱联用[5]以及选择式快速前处理测定[6]等。这些方法虽然精密度和准确度较为理想，但大多涉及贵重的仪器和复杂的操作。

本研究采用电化学高分子薄膜聚合技术，以膨大剂为模板、邻苯二胺（OPD）为功能单体在玻碳电极表面制备含有CPPU的邻苯二胺聚合膜（POPD）、然后再将模板分子洗脱并制备出膨大剂分子印迹电化学传感器。经循环伏安法和差分脉冲法完成对该电化学传感器性能的表征。

本研究所建立的分子印迹式传感测定方法可以在保证上述文献方法优势的前提下具有简单、快速、成本低廉、择性好、抗干扰性强等优势。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

CS300电化学数据处理工作站（郑州合众仪器有限公司）；三电极系统：玻碳电极（GCE）/自制分子印迹电化学传感器为工作电极、Ag/AgCl为参比电极、铂丝电极（天津兰力科科技发展有限公司）为辅助电极；KH-500DY型超声波清洗器（苏州文良科学仪器有限公司）；PHS-3C酸度计（上海仪电科学仪器股份限公司）；FA1004型电子天平（上海恒平天平仪器有限公司）。

氯吡脲（木木生物科学技术有限公司），邻苯二胺（阿拉丁试剂公司），铁氰化钾、甲醇、冰乙酸（天津市科密欧化学试剂有限公司），无水乙酸钠（天津市大茂化学试剂有限公司），a-氧化铝抛光粉（天津艾达恒晟科技发展有限公司），DL-组氨酸（国药集团化学试剂有限公司），DL-懒氨酸（国药集团化学试剂有限公司）。所有实验用试剂均为分析纯，实验用水为蒸馏过的去离子水。

1.2 实验方法

1.2.1 玻碳电极预处理

将GCE在3600#金相砂纸上打磨，之后在麂皮垫上分别用1.0和0.05 μm的Al2O3抛光，再依次用去离子水、HNO3(1：1)、无水乙醇和去离子水分别超声清洗5 min。然后将清洗后的GCE置于H2SO4（0.5 mol/L）溶液中，以50 mV/s的扫描速度在-0.5～+1.4 V 的电位区间内进行扫描，直至无峰出现为止[7-10]。将电极取出后用去离子蒸馏水冲洗干净，然后保存于该纯化水中备用。

1.2.2 膨大剂分子印迹传感器的制备

将处理好的玻碳电极置于含0.2 mg/mL膨大剂、0.1 mg/mL邻苯二胺和pH为4.8的醋酸钠缓冲溶液中，采用循环伏安法（设置电位范围为-0.2V～1.2 V、扫速为50 mV/s），循环扫描约15圈后既可以在GCE表面聚合生成POPD薄膜。待电聚合反应完成之后，将所得的含有特征薄膜的修饰电极置于1 M盐酸-甲醇（1∶1，V∶V）混合溶液中，以铁氰化钾为探针洗脱模板分子，最终得到了保留有膨大剂构型空穴的POPD/GCE分子印迹膜电化学传感器。在相同的实验条件下制备不含有模版分子的聚邻苯二胺薄膜修饰玻碳电极。

2 结果与讨论

2.1 分子印迹敏感膜聚合与表征

按前述实验方法，采用电化学聚合技术在基体玻碳电极上制备了聚合物薄膜。膨大剂和邻苯二胺在玻碳电极表面电聚合过程的循环伏安曲线由图1所示。由图1得知，聚合单体和模版分子在电聚合过程中随着电化学聚合时间的增加，峰电流不断降低。这表明该玻碳电极表面已经形成致密绝缘的聚合膜（POPD），并且薄膜厚度虽聚合时间增加而增大[11]。由于该薄膜导电性远远低于玻碳电极，所以导电性降低、峰电流下降。

从分子组成可以看出，在GCE表面，膨大剂分子中的羟基和聚合邻苯二胺分子中的氨基将形成氢键，从而使CPPU分子嵌入到POPD薄膜之中。在50 mV/s扫速下、-0.2～1.2 V的电位范围内、K3[Fe(CN)6]为探针，分别扫描了 CPPU/POPD/GCE、MIP/GCE和GCE为传感膜的循环伏安曲线。由图2得知，K3[Fe(CN)6]探针在除去模板分子后印迹膜上的峰电流（曲线b）比在裸玻碳电极上的峰电流（曲线a）小得多。而非印迹膜修饰电极经甲醇-盐酸浸泡后仍无电化学活性（曲线 c）。这可能是因为印迹膜的绝缘性，探针离子无法到达GCE表面实现电子传递。当印迹膜中的CPPU被洗脱时，膜上留下了印迹孔穴，即而可以作为探针离子电子传递的通道，所以MIP/GCE工作电极产生了较低的峰电流（曲线b）。

图1 分子印迹膜形成过程的循环伏安曲线

图2 不同修饰膜电极循环伏安曲线a-GCE; b-MIP/GCE;c-CPPU/POPD/GCE

上述实验结果表明，POPD印迹膜的绝缘性阻碍了电子向电极表面的扩散。在加入模板分子之后，溶液中的CPPU分子中的羟基即与OPD分子中的氨基形成氢键而相结合，由此印迹分子便嵌入了OPD聚合膜中。当用甲醇-盐酸洗脱该聚合物薄膜中的模板分子 CPPU之后，聚薄膜中便留有一定数量的与CPPU分子的印迹空穴。该印迹空穴虽然会产生相应的电化学响应，但由于空穴对电荷传递的阻碍作用的存在，使其峰电流会低于模板洗脱前的状态。

2.2 分子印迹传感器和非分子印迹电极的对比

在K3[Fe(CN)6]（5 mmol/L）溶液中、-0.2～1.2 V电位范围内，采用DPV法（电位增量5 mV/s，振幅25 mV/s，脉冲周期0.20 s，脉冲宽度50 ms）分别对比测试了分子MIP/GCE与NIP/GCE的电化学性能，结果如图3所示。由图中得知，曲线4的峰电流峰电流最高。这可能是由于GCE表面无传质阻碍作用所致。图中曲线 1为聚合单体中未加入印迹膜（NIP/GCE）的探针脉冲伏安曲线，其峰电流接近于零。这可能是聚苯二胺的电绝缘性以及聚合膜洗脱后未留下CPPU印迹孔穴，所以探针分子无法通过孔穴与电极接触，所以导致了峰电流最低。

由曲线3得知，将制备好的膨大剂印迹电极浸入含有CPPU的溶液中吸附一定时间之后，发现该电极对目标分子响应的峰电流较吸附前（曲线3）出现降低的现象（曲线2）。这可能是由于当CPPU印迹孔穴进行特异性识别的同时，该目标分子也占据了印迹孔穴。由此可以说明洗脱模版后的分子印迹膜中的空穴对CPPU有一定的选择性。

图3 不同电极在铁氰化钾探针溶液中的脉冲伏安曲线1-未添加模板分子的 NIP/GCE电极；2-在目标分子溶液中吸附5min后的MIP/GCE电极；3-洗脱2min后的MIP/GC电极；4-GCE电极

2.3 印迹过程原理分析

关于邻苯二胺电聚合机理已有相关推论的文献[12]，然而在膨大剂作为模版分子条件下的电化学反应机理尚未见报道。依据待测物与邻苯二胺的分子结构，可以推测所制备的传感器具有如下所示的电化学响应机制（方程式中的□符号代表印迹空穴）。

（1）电化学聚合前，反应底液中的邻苯二胺与膨大剂分子通过氢键相结合：

（2）邻苯二胺氧化生成阳离子自由基（在电聚合的第一圈时有一个单体的强氧化峰）：

（3）自由基聚合：

（4）二聚体易被氧化：

（5）形成环状聚合物：

最后生成聚邻苯二胺，膨大剂由于分子间的氢键作用而嵌入其中：

（6）印迹检测

当用溶剂将聚合物中的膨大剂模板分子洗脱后，聚合薄膜表面便留下了该分子所印迹的空穴，当其再次与膨大剂溶液相接触时，在氢键力作用下目标分子便与空穴位点发生印迹式的结合[9,13]：

2.4 实验条件条件优化

2.4.1 甲醇-盐酸用量比和模板洗脱时间

甲醇与盐酸的混合溶液对电极进行洗脱，因两者的比例不同会对峰电流有影响，因此，分别做了甲醇与盐酸体积比为 2∶5、3∶5、1∶1、4∶5、5∶2 和 5∶3 对峰电流的影响，如图4所示，1∶1时峰电流最高。在5 mmol/L的探针溶液中，采用循环伏安法考察了洗脱时间对模板分子的洗脱效果的影响。图 5为CPPU/POPD/GCE分别洗脱5～30 min的峰电流曲线，从中可以看出，洗脱时间为25 min时峰电流值最大，因此选择最佳洗脱时间为25 min。

图4 甲醇-盐酸用量比优化曲线图

图5 洗脱时间优化曲线图

2.4.2 缓冲溶液的选择和电聚合过程缓冲溶液pH

在相同的实验条件下，研究了不同聚合物底液中不同支持电解质对所制得的膨大剂分子印迹传感器电活性的影响。将一定浓度的膨大剂与邻苯二胺分别加入乙酸-乙酸钠缓冲液和磷酸缓冲液中，然后浸入至K3[Fe(CN)6]溶液中，通过CV法对比二者对印迹膜稳定性的影响。由图 6得知，在乙酸-乙酸钠缓冲溶液中制得的传感器印迹膜更加稳定，说明该缓冲溶液的pH值对分子印迹膜的形成有着一定的影响。即POPD在酸性条件下聚合较为容易，而在碱性条件下却会出现印迹膜消失的现象[14]。在4.4～5.6的pH值范围内考察了 pH对峰电流的影响。结果表明，在pH=4.8时峰形最佳，为此选择 pH=4.8的乙酸-乙酸钠缓冲溶液做为测试用电解质溶液。

图6 缓冲液的优化曲线图

2.4.3 单体与模板用量比和膨大剂与缓冲液的用量比

单体与模板用量比较小时，不利于单体之间的聚合，而单体用量过多时又会产生对模板分子的包埋现象，不利于洗脱[15]。试验中分别考察了苯二胺与膨大剂用量比为 1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1 条件下的峰电流。结果表明在用量比为 2∶1时，峰电流最大。膨大剂易溶于甲醇，微溶于水，故本实验选用甲醇作为溶剂。为此，探讨了该膨大剂溶液与缓冲溶液体积比分别为 1∶8、1∶7、1∶6、1∶5、1∶4 和 1∶3 时对峰电流的影响，实验结果表明，当比值为1∶6时峰电流最高。

2.4.4 聚合圈数的选择

聚合扫描圈数是影响分子印迹传感器膜形成的重要影响因素。实验中以下几种聚合圈数：10圈、15圈、20圈、25圈和30圈。实验结果表明，在聚合15圈之后的膜质量更好、印迹膜表明的活性空穴更多；在扫描10圈的条件下，峰电流较低。这可能是由于聚合时间过短，印迹分子没有更好的聚合在膜上，从而导致电流响应减弱；当扫描20圈和25圈并洗脱模版后的峰电流与扫描15圈相比没有明显增加；且30圈的实验效果不好，几乎没有产生峰电流，所以扫描15圈做为电化学聚合的最佳条件。

2.4.5 扫描速度的选择

不同扫描速度下制备的聚合物膜电极性能不同。扫描太快，单体来不及扩散到电极表面，生成的聚合物膜薄且不紧密。扫描过慢又会导致薄膜过后。试验中分别考察了扫描速度20～150 mV/s时的峰电流。结果表明扫描速度为50 mV/s条件下峰电流值为最大。

2.5 重线性、稳定性和工作曲线

在优化过的实验条件下，测定了MIP /GCE 在膨大剂标准溶液中浸泡后对 K3[Fe(CN)6]峰电流的响应曲线。结果表明，随着浸泡时间的增加，峰电流逐渐降低，7 min后峰电流基本不变。为此选择的最佳吸附时间为 7 min。图 7给出了不同浓度的 CPPU在MIP/GCE电极上的峰电流曲线。浓度在5×10-6～2.0×10-4mg/mL范围内，CPPU浓度与电极峰电流之间具有良好的线性关系，线性方程为 Ip(μA)＝－1.9537c +4.7949(mg/mL)，相关系数为0.9604。相同条件下制备了10支MIP/GCE电极，并且平行测定0.25 mg/mL和2.0 mg/mL的CPPU溶液。该测定结果的RSD分别为6.85%和1.39%，可见其重现性较好。该传感器在印迹使用后，经过超声洗脱印迹上的目标分子5 min即可恢复至印迹传感器状态。将用后的膨大剂传感电极洗净晾置于空气中，15天后对CPPU的响应电流降为原来的81%，由此可以得知该传感器稳定性较好。

图7 不同浓度膨大剂标准溶液在MIP/GCE电极上的CV曲线C（1～7）：0.05，0.1，0.25，0.5，1.0，1.5，2.0 mg/mLCPPU

2.6 分子印迹电极的选择性

选择与膨大剂结构类似的DL-组氨酸，DL-懒氨酸作为干扰物质，分别考察了对0.25 mg/mL膨大剂测定结果的影响（表 1）。结果表明，两种物质的存在对CPPU的检测基本不会带来误差干扰。

表1 膨大剂分子印迹电极的选择性

2.7 样品分析及加标回收率实验

选择在种植过程中未添加 CPPU的西瓜做为实验样品并中加入了已知量的CPPU，然后在前述实验条件下，用标准曲线法测试了样品中膨大剂含量和加标回收率。测定结果表明（表 2），该分子印迹电极可以应用于实际样品中膨大剂含量的测定，其测定结果的准确度较为理想。

表2 样品加标回收率测定结果

3 结论

基于电化学聚合方法，以邻苯二胺为功能基体、在无交联剂存在的条件下制备了膨大剂分子印迹传感器。该传感器具有较好的选择性、灵敏度和稳定性。实验结果表明，膨大剂在该传感器上的氧化峰电流与其浓度有良好的线性关系。该分子印迹传感器可应用于水果及蔬菜中的膨大剂残留量测定。

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Research of Molecularly Imprinted Electrochemical Sensor for Forchlorfenuron

SHEN Gui-jun1，LI Ya-ru1，GU Ling-yan1, ZHAO Zhi-wei1, GONG Xiao-jie2,*
（1 College of Environmental and Chemical Engineering, Dalian University, Dalian 116622, China; 2. College of Medicine, Dalian University, Dalian 116622, China）

Forchlorfenuron(CPPU) as a template molecule, o-phenylenediamine as functional monomer, preparation and characteristics of molecularly imprinted electrode for forchlorfenuron were studied, set up a new electrochemical analysis method for determination of forchlorfenuron. By cyclic voltammetry and differential pulse voltammetry method to study the selectivity and sensitivity of the electrode, the results showed that the molecularly imprinted electrode had significant catalytic reduction and selective action for forchlorfenuron molecule. In pH=4.8 of acetic acid-sodium acetate buffer solution, the current and the concentration of forchlorfenuron within 0.05mg/mL-2.0 mg/mL showed a good linear relationship, and the minimum detection limit was 0.01 mg/mL. The method was simple, can be used for the determination of content of forchlorfenuron of the watermelon.

forchlorfenuron; imprinting; differential pulse voltammetry; o-phenylenediamine

O657.1

A

1008-2395(2015)06-0005-06

2015-05-21

国家自然科学基金(81172949)。

申贵隽（1957-），男，博士，研究方向：分析化学。

弓晓杰（1963-），男，教授，博士，研究方向：天然产物化学。