新疆传统烤馕酵子中乳酸菌的分子生物学鉴定

朱晓莹， 吐汗姑丽， 努尔古丽·热合曼（新疆师范大学生命科学学院，新疆乌鲁木齐830054）

新疆传统烤馕酵子中乳酸菌的分子生物学鉴定

朱晓莹， 吐汗姑丽， 努尔古丽·热合曼
（新疆师范大学生命科学学院，新疆乌鲁木齐830054）

文章采集新疆吐鲁番地区传统家庭用烤馕酵子，对酵子中的细菌进行分析。应用传统分离培养方法分离得到乳酸菌15株，均为革兰氏阳性。提取菌株DNA，扩增16S rDNA序列，并测序。乳酸菌16S rDNA序列可分为四组，所得乳酸菌分别与清酒乳杆菌Lactobacillus sakei、戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus、肠球菌Enterococcus、弯曲乳杆菌Lactobacillus curvatus序列相似率达到99%，初步解析了新疆馕饼酵子中优势乳酸菌种类。

乳酸菌；16S rDNA；传统酵子；分子鉴定

馕饼是新疆群众饮食中的传统主食，据考证，烤馕的历史距今已有2000余年［1］。馕具有养生保健的重要功用，从其制作过程和原料选择上，馕都很适合新疆这样的风寒地区，此外，馕饼还有很好的润通肠道、保养脾胃、调节气血等功效［2］。新疆馕饼的制作包括和面、发酵、制形、烘烤等工序，其中发酵过程直接影响着馕饼的口感和品质。发酵所使用的发酵剂维吾尔族人常称为“老酵头”或酵子，它的选择和使用决定着馕饼的口感和品质。

新疆部分维吾尔族家庭使用胡杨树皮煮出的水和面做酵头，制作出风味独特的馕饼，并有很高的营养价值。本研究以采集自南疆传统维吾尔族家庭的老酵头为研究对象，用传统分离方法结合分子鉴定技术，分离鉴定其中的乳酸菌，以期得到新疆特殊微生物菌株资源，为保护和发扬新疆特殊产业提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳酸菌菌种分别从吐鲁番坎儿井水、库尔勒地区胡杨树水和面制成的面团中分离得到。

乳酸菌16S rDNA引物［4］：上游5＇－AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG－3＇；下游：5’GGC TAC CTT GTT ACG ACT 3’，上海生工；D501A、DL2000 DNA Marker，大连宝生物公司；PCR试剂盒、Goldview核酸染料，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

革兰氏染色液［4］、1mol／L pH8.0 Tris－HCl、20mg／L蛋白酶K、10mg／mL溶菌酶，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；50×TAE（Tris－乙酸）；

MRS培养基［4］：蛋白胨10g，Yeastextract5g，K2HPO42g，柠檬酸三胺2g，MnSO40.05g，MgSO40.28g，葡萄糖20g，牛肉膏8g，琼脂16～20g，无水乙酸钠5g，TWIN 80 1mL，PH值7.0～7.2，加水至1000mL，112℃灭菌20分钟。

1.2 仪器与设备

台式高速离心机，德国SIGMA公司；PCR核酸扩增仪，美国应用生物系统公司；BCD－208K／A海尔冰箱，青岛海尔股份有限公司；立式压力蒸汽灭菌锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；PL303－IC电子分析天平，梅特勒有限公司；Alpha Innotech Imager EP凝胶成像分析系统，美国阿尔法科技公司；GHP－9270型电热恒温培养箱，上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 胡杨树水面团中乳酸菌的分离与纯化

取酵头5g，加45 ml无菌水浓度为10－1，用试管依次稀释至10－6。用枪分别吸取10－4，10－5，10－6稀释液各0.2 mL涂布于MRS培养基，37℃恒温培养24－36 h，3次单菌落分离得到纯培养物，观察形态，镜检。

1.3.2 乳酸菌的DNA提取

从每组分离出的酵母菌和乳酸菌中，选取外观形态与其它菌不同的菌株提取DNA，取已纯化菌液1Ʊ5ml，12000rpm离心1min，去除上清液，DNA提取按照沈萍《微生物学实验》中细菌总DNA提取方法。

1.3.3 乳酸菌的分子鉴定

PCR扩增条件［4］：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。PCR产物送上海生工进行测序，测序结果经NCBIBLAST分析后，使用mega4.0软件制作进化树。

2 结果与分析

2.1 从酵头中分离得到的乳酸菌形态观察结果

从不同稀释度的样品中得到三组菌，经革兰氏染色，均为G＋菌（图1）。

图1 显微镜下乳酸菌图片（10×100）a：Z－3；b：Z－12

2.2 乳酸菌分子鉴定结果

从乳酸菌中选取每组代表菌株，提取DNA。常规PCR用16SrDNA进行扩增，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像仪成像拍照。

图2 乳酸菌菌株16SrDNA琼脂糖凝胶电泳图

PCR产物送到上海生工进行测序，测序结果结果采用EditSeq程序进行拼接。登陆NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov／blast／），将所得序列与数据库中已知序列比对分析。

图3 菌株Z－3、Z－4和Z－12、km－6系统进化树

从进化树中可以看出，菌株Z－3、Z－4、Z－12分别与GeneBank中的粪肠球菌Enterococcus faecalis、清酒乳杆菌Lactobacillus sakei、戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus，相似率最高。而自吐鲁番地区分离得到的菌株km－6与其余三种菌株差异较大。

3 结论与讨论

酸面团（酵子，起子）是发酵食品中重要的发酵剂，研究表明，酸面团是一个稳定而复杂的微生态体系，其中包括复杂的生化关系和微生物互作关系［5］。国内有大量馒头民间发酵剂的研究，也有不少研究者在民间酵面的研究上取得好的成果。研究发现，用传统老酵头发酵的家庭馒头口感明显高于工厂用商品干酵母发酵的馒头［6－7］。在面团中添加乳酸菌可以改善面团的发酵性，发酵出来的馒头品质也得到改善，而酵母菌和乳酸菌组成复合菌种发酵出的馒头相较于商品酵母粉发酵的馒头储存时间明显延长，这对于延长发酵食品货架期有很大潜力［8］。传统酵子制作过程中，每个阶段生理生化性质都在变化，微生物种群构成也有很大变化，多数表现为细菌总数下降，酵母菌数量上升［9－10］。

传统发酵剂是由多种乳酸菌和酵母菌增殖形成的稳定的微生态环境，可用于发酵面包、馒头等主食［11］。利用DGGE技术和16S rDNA测序技术，可鉴定出传统发酵剂中的微生物有链球菌、乳球菌、乳杆菌、明串珠菌等［12］。对菌株16S rDNA序列测序，在NCBI上比对分析，可简便、快捷地分析传统食品中微生物组份，武运等［3］就用传统分离和分子生物学相结合的方法对新疆哈萨克族发酵酸驼乳中的部分菌株进行分析，证实对乳酸菌16SrDNA进行分析，可方便、快速鉴定出发酵食品中含有的细菌。

多数研究表明，发酵剂中的主要成分为乳酸菌，乳酸菌和酵母菌在发酵系统中并非独自发酵，而是经过代谢提供对方所需营养物质［13，14］。我们在研究中也发现，有的样品中乳酸菌和酵母菌不能分离，两者可在同一种培养基上生长，并且出现乳酸菌围绕酵母菌生长的现象。

新疆地处西北，气候环境特殊，生活在这里的人们逐渐形成传统饮食方式。努尔古丽［15］就利用PCRDGGE技术对新疆发酵饮料—博扎中酸驼乳中微生物分子区系进行了解析，发现新疆博扎中微生物的种类有特殊的种群，这种差异可能是由地区环境、当地居民的制作工艺导致的。朱晓莹［16］等从新疆特色发酵乳中筛选到可耐受胃肠道胆盐的乳酸菌菌株，这些乳酸菌的产生与当地居民爱好酸度较高的酸奶有关。这些研究均显示，新疆地区环境的特殊性孕育了特殊的微生物资源，某些微生物可被开发利用为优良益生菌。维吾尔族烤馕是当地居民的传统主食，不仅库尔勒地方维吾尔族人用胡杨树水和面发酵馕饼，吐鲁番地区的人们用坎儿井水直接和面不加发酵剂，制作出来的馕饼也别具风格。新疆馕饼发酵和烘焙过程与馒头差别很大，发酵用的酵子与馒头酵面在形态上有很大差别，而且维吾尔人烤馕保存时间长，一般可以保存半月以上。这可能与新疆的干旱环境相关，但其中仍可能蕴含特殊的微生物种群。目前尚未有关于新疆馕饼中微生物组分的研究，仅本试验对库尔勒和吐鲁番地区的酵子进行分析，发现其中蕴含丰富的乳酸菌种群，与前人研究的其它发酵食品酵子中的乳酸菌种类不同。研究馕饼传统发酵剂中的微生物，既是对新疆传统食品的传承，也是为开发优质乳酸菌制剂提供理论依据。

文章结合16S rDNA序列测序方法，测序结果通过NCBI数据库比对，并根据比对结果和已报道的乳酸菌16S rDNA用mega4.0软件进行系统发育分析表明：菌株Z－3、Z－4、Z－12分别与GeneBank中的粪肠球菌Enterococcus faecalis、清酒乳杆菌Lactobacillus sakei、戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus，相似率最高。而自吐鲁番地区分离得到的菌株km－6与标准菌株比对差异较大，与库尔勒地区酵子中的乳酸菌同源性很低。对分离的菌株做葡萄糖发酵试验，菌株T13产酸产气能力较强，可以作为其他用途的优良菌株。

此结果表明，传统馕饼酵头中的微生物组份有其特殊性。此外，在显微镜下，样品中的微生物种类多，但分离纯化得到的微生物种类少，老酵头中可能包含部分不能在培养基上培养的微生物，仅应用分子生物学方法对已分离纯化的菌株进行分析，结果不全面，应采用其他方法，如PCR－DGGE分析方法对老酵头中微生物区系进行解析，以期得到新疆馕饼老酵头中优质微生物资源，这些研究将为今后为研发适合于馕饼面团发酵的发酵剂方面提供益生微生物组分方面的理论依据。

［1］何婧云，张磊.维吾尔族食馕习俗的文化解说［J］.安徽农业科学，2005，33（11）：2220－2222.

［2］热莎拉提·玉苏普.新疆维吾尔族的特色食品—馕的基本解读［J］.康定民族师范高等专科学校学报，2007，16（2）：17－20.

［3］沈萍，陈向东.微生物学实验［M］.北京：高等教育出版社，2007.

［4］武运，黄彭等.新疆哈萨克族发酵酸驼乳中乳酸菌的分子生物学鉴定［J］.食品科学，2011，32（1）：173－176.

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［8］李自红.传统发酵剂微生物的筛选、鉴定及对馒头品质的影响［D］.河南工业大学硕士论文，2011.

［9］杨敬雨，刘长虹.传统酵子制作过程中理化指标变化的研究［J］.粮油加工，2006，10：70－72.

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［11］吴斯日古冷.内蒙古西部地区酸面团中酵母菌和乳酸菌的分离鉴定及其生物多样性研究［D］.内蒙古农业大学硕士论文，2011.

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［15］努尔古丽·热合曼，华长春，朱晓莹.新疆柯尔克孜族传统发酵饮料博扎中微生物群落结构的PCR－DGGE分析［J］.食品科学，2012，33（1）：111－114.

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M olecular Biological Identification of Lactic Acid Bacteria in Xinjiang Nang Fermented Starter

ZHU Xiao－ying， TUHANGULI， Nurguli·REHEMAN
（College ofMicrobiology，Xinjiang Normal University，Urumqi，Xinjiang，830054，China）

In this study，bacteria from roasted Nang old starter was analyzed，the sampleswere collected from traditional Uygur family.Traditional protocol was used，and 15 lactic acid bacteria strains have been isolated by plate streaking，they are all Gram－positive.Then we have extracted DNA ion，did PCR amplification and analyzed 16S rDNA of 15 strains.4 groups are established by sequencing analyses.Results show that4 groups are 99%per⁃cent similar to Lactobacillus sakei，Pediococcuspentosaceus，Enterococcus，and Lactobacillus curvatus privately.This study has analyzed lactic acid bacteria in Xinjiang Nang old starter preliminary.

Lactic acid bacteria；16S rDNA；Old starter；Molecular biology identification

Q939.1

A

1008⁃9659（2015）02⁃019⁃05

2015－03－18

新疆师范大学优秀青年教师科研启动基金项目（XJNU1118）；新疆师范大学微生物学重点学科资助。

朱晓莹（1986－），女，新疆乌鲁木齐人，硕士，实验师，主要从事应用微生物方面研究。