骨髓胚胎样干细胞体内重建dystrophin的表达

庞荣清，王强，杨建勇，朱光旭，李自安，何洁，朱向情，阮光萍，潘兴华

骨髓胚胎样干细胞体内重建dystrophin的表达

庞荣清，王强，杨建勇，朱光旭，李自安，何洁，朱向情，阮光萍，潘兴华

目的观察骨髓胚胎样干细胞体内再生dystrophin的可行性。方法采用SSP-PCR方法鉴定mdx小鼠的基因型。分离扩增人骨髓胚胎样干细胞，采用DIR标记后，注射细胞到mdx小鼠腹股沟三角皮下，采用活体成像法观察植入细胞的存活情况，采用免疫荧光染色法检测dystrophin的表达。结果杂合子鼠交配可以产生3个基因型的子代鼠，采用SSP-PCR可以鉴定出mdx小鼠基因型；采用无血清培养基可从骨髓中分离到表达SSEA-4和FZD-9的胚胎样干细胞，可在注射细胞的mdx小鼠离体后肢肌肉检测到明显的荧光信号，并在肌肉组织中检测到人dystrophin的表达。结论人骨髓胚胎样干细胞可在mdx小鼠体内存活并表达dystrophin。

骨髓；胚胎样干细胞；mdx小鼠；基因型；dystrophin；Duchenne型肌营养不良

Duchenne型肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是临床上常见的神经内科遗传病，目前尚无有效治疗方法[1]。研究DMD治疗、尤其是干细胞治疗，mdx小鼠是常用的动物模型[2]。本课题前期研究[3]表明，从骨髓中可以分离获得表达多潜能抗原标志的胚胎样干细胞(embryonic-like stem cells，ELSCs)，这些细胞已成为目前成体干细胞生物学研究的一个亮点。本实验以mdx小鼠为研究对象，探讨骨髓胚胎样干细胞在体内再生dystrophin的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂器材DMD模型种鼠(牛津大学Davies教授惠赠，检疫许可证号AD44010011)，饲养于屏障系统动物实验室[SYXK(滇)2013-0011]；无血清培养基和trypsin-EDTA均为invitrogen公司生产；一抗鼠抗人dystrophin和FITC标记的羊抗鼠IgG均为Santa Cruz公司生产；细胞膜荧光探针DIR碘化物为北京泛博生化有限公司生产；活体成像仪为Maestro in vivo imaging system。

1.2 mdx小鼠鉴定种鼠生产的子代鼠，采集其外周血提取基因组DNA。按本课题组建立的序列特异性引物(sequence specific primers，SSP)-PCR法进行基因型鉴定[4]。上游引物：5′-GTGAAGGATGTCATGAAA G-3′，下游引物1：5′-TGAAGTCCGAAAGAGATACC-3′，下游引物2：5′-ACGAGACTAGTGAGACGTGC-3′。PCR反应条件为：95℃5min，94℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，进行35个循环，最后72℃延伸10 min。采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，溴化乙锭染色后紫外灯下观察拍照。

1.3 ELSCs的准备按照本课题组建立的方法[3]分离扩增ELSCs，即采集人骨髓，无菌条件下分离骨髓单个核细胞，加入无血清培养基重悬单个核细胞后，转移到明胶包被过的培养瓶中培养。无血清培养基是含有20%SR、2mM glutamine、1%NEAA、0.1mM 2-mercaptoethanol和5 ng/ml bFGF的k-DMEM培养液。加入0.1%明胶溶液至培养瓶中静置30 min，吸弃明胶溶液后自然风干，即可包被培养瓶。光学显微镜下观察细胞生长情况及形态特征。适时换液并及时用trypsin/EDTA消化传代细胞。第3代ELSCs用于实验研究。

1.4 细胞注射及活体成像观察参照文献[5]报道方法，加入0.1%DIR溶液与生长良好的第3代细胞共培养8 h，收集并调整细胞密度为1×106/ml，在用于实验研究的mdx小鼠腹股沟三角皮下注射2 ml细胞悬液，对照mdx小鼠注射无细胞的等量基础培养液。1个月后处死小鼠，取其后肢去除皮肤后，于活体成像仪下拍照。

1.5 人dystrophin的检测参照本课题组建立的技术方法[4]，处死小鼠取少许股直肌肌肉制作冰冻切片，室温条件下加入10%正常羊血清封闭1 h，滴加一抗mouse anti-human dystrophin 4℃孵育过夜，漂洗后加入二抗FITC-goat anti-mouse IgG于室温反应1 h，漂洗后，荧光显微镜下观察拍照。

2 结果

2.1 mdx小鼠的鉴定采用SSP-PCR方法可以准确地将子代小鼠鉴定为3种基因型，其中只扩增出一个340 bp条带的小鼠（图1），即为表达utrophin基因而不表达dystrophin基因的mdx小鼠，适于干细胞治疗实验研究。

图1 3种基因型小鼠的SSP-PCR电泳图

2.2 ELSCs的分离培养采用无血清培养基在明胶包被过的培养瓶中培养骨髓单个核细胞，可分离到贴壁生长、体积较小、形态纤细的细胞，即ELSCs（图2A），细胞传代后在瓶中均匀分布生长（图2B）。流式分析显示ELSCs表达SSEA-4和FZD-9。

图2 ELSCs的形态特征及流式分析

2.3 活体成像观察注射DIR标记细胞的mdx小鼠，在去除皮肤的后肢股直肌和腓肠肌等部位可以检测到明显的荧光信号，而没有注射细胞的对照鼠后肢肌肉则检测不到荧光信号的存在（图3）。

图3 离体mdx小鼠后肢荧光成像分析

2.4 荧光免疫染色分析皮下注射ELSCs的mdx小鼠，1个月后检测到了人dystrophin的表达，而没有注射细胞的对照小鼠只观察到极其微弱的荧光背景，检测不到dystrophin的表达（图4）。

3 讨论

由于位于X染色体上的dystrophin基因突变或缺失，导致dystrophin蛋白表达障碍，是DMD发病的主要原因。位于肌细胞膜上的dystrophin蛋白与肌纤维膜糖蛋白结合为抗肌萎缩蛋白复合体，这些蛋白与肌细胞的黏附蛋白联结，共同构成细胞支架，共同维持着肌纤维的稳定[6]。表达utrophin基因而不表达dystrophin基因的mdx小鼠，虽然基因代偿的缘故其临床症状不如临床上DMD患者那样严重，但这种小鼠能够长期存活，仍然成为DMD研究最常用的动物模型。

图4 人dystrophin荧光免疫染色分析

干细胞移植治疗DMD的原理，就是通过输入健康供体来源的干细胞到DMD体内，以重建dystrophin蛋白的表达。我们已经从骨髓中可以分离获得表达多潜能抗原标志的ELSCs，并证明ELSCs具有较强的成肌分化能力[3]。本研究采用前期研究建立的无血清培养方法分离获得ELSCs，将其用DIR标记后注射到mdx小鼠腹股沟三角皮下，可以在mdx小鼠后肢肌肉丰富的区域检测到明显的荧光信号，表明注入皮下的细胞可以就近分布到肌肉丰富的区域定植；免疫荧光检测分析可以检测到人dystrophin的表达，表明人骨髓来源的ELSCs可在mdx小鼠体内再生dystrophin，这与研究报道一致[7]。

ELSCs之所以引人关注，主要原因就是它们能表达多潜能的抗原标志，如VSEL被认为是成体组织中真正意义上的干细胞，是再生医学研究中真正的种子细胞[8]。流式分析显示：ELSCs表达SSEA-4和FZD-9，前者是胚胎干细胞的抗原标志[9]，后者虽不是多潜能抗原标志，但FZD-9阳性的细胞表达了更多的多潜能抗原标志[10]，说明FZD-9与多潜能抗原标志的表达有关。本研究检测到人源dystrophin在mdx的表达，说明ELSCs有可能被用于DMD的治疗，而前期研究表明，ELSCs拥有更强的成肌分化能力，说明ELSCs可能是DMD治疗更好的种子细胞。

[1]刘焯霖，梁秀龄，张成.神经遗传病[M].2版.北京:人民卫生出版社,2002:27-216.

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[3]Pang RQ,Zhang YY,Pan XH,et al.Embryonic-like stem cell derived from adult bone marrow:immature morphology,cell surface markers,ultramicrostructure and differentiation into multinucleated fibers in vitro[J].Cell Mol Biol,2010,56:1276-1285.

[4]Li Z,Liu HY,Lei QF,et al.Improved motor function in dko mice by intravenous transplantation of bone marrow-derived mesenchymal stromal cells[J].Cytotherapy,2011,13(1):69-77.

[5]张佳琳，熊晔蓉，涂家生.精氨酸水溶液复溶的多西他赛聚合物胶束的体外药效学及体内分布[J].药学与临床研究, 2013,21(3):224-226.

[6]Hoffman EP,Brown RH,Kunkel LM.Dystrophin:the protein product of the Duchennemuscular dystrophy locus[J].Cell,1987, 51:919-928.

[7]Secco M,Bueno CJ,Vieira NM,et al.Systemic delivery of human mesenchymal stromal cells combined with IGF-1 enhancesmuscle functional recovery in LAMA2dy/2j dystrophic mice[J].Stem Cell Rev,2013,9(1):93-109.

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[10]Battula VL,Treml S,Abele H,et al.Prospective isolation and characterization ofmesenchymal stem cells from human placenta using a frizzled-9-specificmonoclonal antibody[J].Differentiation, 2008,76(4):326-336.

Expression of dystrophin reconstructed by bonemarrow embryonic-like stem cells in vivo

Pang Rongqing,Wang Qiang,Yang Jianyong,Zhu Guangxu,Li Zian,He Jie,Zhu Xiangqing,Ruan Guangping,Pan Xinghua Cell Biological Therapy Center of Kunming General Hospital of Chengdu Military Command/The Nation and Region Integrated Engineering Laboratory of Stem Cell and Immunocyte Biological Technology/Key Laboratory of Cell Therapeutic Transforming Medicine of Yunnan Province/Stem Cell Engineering Laboratory of Yunnan Province,Kunming,Yunnan,650032,China

Objective To observe the feasibility of the dystrophin regeneration by bone marrow embryonic-like stem cells (ELSCs)in vivo.Methods SSP-PCR was used to identify the mdx mice's genotype.Human bone marrow embryonic-like stem cells were separated,isolated,and then after the marking by DIR,subcutaneously injected into the mdx mice's inguinal triangle.The survival of implanted cells was observed by living-imagingmethod,and the dystrophin expression was detected by immunofluorescent staining method.Results The copulation of heterozygousmice could breed offspring with three kinds of genotype.The genotype of mdx mice could be identified by SSP-PCR.ELSCs expressing SSEA-4 and FZD-9 could be isolated from the bone marrow through serum-free medium.Significant fluorescence signal was detected in the ex vivo posterior limb muscle of the mdx mice that were injected with the cells,and the expression of dystrophin was detected in the muscle tissues.Conclusion Human bone marrow embryonic-like stem cells can survivewithinmdxmice and express dystrophin.

bonemarrow;serum-freemedium;mdxmouse;genotype;dystrophin;Duchennemuscular dystrophy

R 318.1

A

1004-0188（2015）08-0823-03

10.3969/j.issn.1004-0188.2015.08.004

2015-04-10）

云南省基金项目(2011HB050,2013DA004,2013CA005)；成都军区基金项目（2012WJ003)；国家自然科学基金项目（31172170）

650032昆明，成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心,干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室,云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室,云南省干细胞工程实验室

潘兴华，电话:0871-64774773；E-mail:xinghuapang@ aliyun.com