毒毛旋花子阿洛糖苷诱导胃腺癌细胞SGC-7901凋亡作用及机制研究

张雪娇，梅文莉，蔡彩虹，董文化，姜 北，黄风迎，戴好富



·论著·

毒毛旋花子阿洛糖苷诱导胃腺癌细胞SGC-7901凋亡作用及机制研究

张雪娇，梅文莉，蔡彩虹，董文化，姜 北，黄风迎，戴好富

目的 探讨毒毛旋花子阿洛糖苷诱导胃腺癌细胞SGC-7901凋亡作用及其机制。方法 将人胃腺癌细胞SGC-7901分为对照组、0.125 μg/ml组、0.250 μg/ml组、0.500 μg/ml组、1.000 μg/ml组，四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)检测毒毛旋花子阿洛糖苷对胃腺癌细胞SGC-7901的生长抑制作用，Hoechst染色和Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)流式细胞术检测细胞凋亡情况，JC-1法检测线粒体膜电位变化，Western blotting法检测线粒体途径相关蛋白细胞色素C、Caspase-3和Caspase-9的表达。结果 MTT结果显示，24 h和48 h时不同组胃腺癌细胞SGC-7901吸光度(A)、生长抑制率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；组间两两比较胃腺癌细胞SGC-7901 A值依次降低、生长抑制率依次升高(P<0.05)。荧光显微镜下观察发现，对照组细胞核显示为蓝荧光且较均匀，0.500 μg/ml组处理12 h后细胞核呈紧密较亮荧光体，颜色较白。不同组胃腺癌细胞SGC-7901总相对死亡率比较，差异有统计学意义(P<0.05)；组间两两比较胃腺癌细胞SGC-7901总相对死亡率依次升高(P<0.05)。JC-1染色结果显示，毒毛旋花子阿洛糖苷处理胃腺癌细胞SGC-7901 12 h后，0.125 μg/ml组、0.250 μg/ml组、0.500 μg/ml组显示绿色荧光，随毒毛旋花子阿洛糖苷浓度的增加绿色荧光增强。Western blotting法显示，随着细胞凋亡的发生，细胞色素C从线粒体中释放到细胞质中，同时，Caspase-3和Caspase-9也被激活并发生剪切活化，活化片段表达增加。结论 毒毛旋花子阿洛糖苷通过线粒体凋亡途径诱导体外培养的人胃腺癌细胞SGC-7901凋亡。

胃肿瘤；毒毛旋花子甙类；线粒体；细胞凋亡

张雪娇，梅文莉，蔡彩虹，等.毒毛旋花子阿洛糖苷诱导胃腺癌细胞SGC-7901凋亡作用及机制研究[J].中国全科医学，2015，18(15)：1743-1747.[www.chinagp.net]

Zhang XJ,Mei WL,Cai CH,et al.Apoptosis of gastric adenocarcinoma cells type SGC-7901 induced by Strophalloside and its mechanism[J].Chinese General Practice，2015，18(15)：1743-1747.

见血封喉为桑科见血封喉属(Antiracism)植物，别名箭毒木，主要分布于东南亚，我国仅产1种，分布于海南、云南等地，其鲜树汁乳白色，有剧毒，民间入药用于强心、催吐、泻下、麻醉等。研究表明，见血封喉乳汁和种子的主要成分为强心苷类化合物，具有强心作用[1-3]。为开发热带药用植物资源，在活性筛选指导下，本实验室从海南产见血封喉的乙醇提取物中分离出一系列强心苷，其中毒毛旋花子阿洛糖苷对胃腺癌细胞SGC-7901具有显著的细胞毒活性[4-5]。长期以来，强心苷在临床上广泛应用于充血性心力衰竭以及其他心源性疾病的治疗，研究也表明，强心苷对恶性肿瘤细胞具有优先选择性杀伤作用，其机制包括诱导肿瘤细胞分化或促进肿瘤细胞凋亡等[6-8]。本研究探讨毒毛旋花子阿洛糖苷对人胃腺癌细胞SGC-7901是否具有诱导凋亡的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人胃腺癌细胞SGC-7901购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库，RPMI Medium 1640培养基购于Solarbio公司，胎牛血清(PBS)购于四季青生物工程材料有限公司，Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、Hoechst染色试剂盒(Hoechst Staining Kit)、线粒体分离试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒、细胞色素C抗体、Caspase-3抗体、Caspase-9抗体、环氧酶(COX)Ⅳ抗体、肌动蛋白(Actin)抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)和辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG(H+L)购于碧云天生物技术研究所。

1.2 细胞培养 人胃腺癌细胞SGC-7901培养于含10%磷酸盐缓冲液(PBS)的RPMI Medium 1640培养基中，置于37 ℃ 5%二氧化碳(CO2)细胞培养箱中培养，0.25%胰酶消化常规传代。

1.3 四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)检测毒毛旋花子阿洛糖苷对细胞的生长抑制作用 将人胃腺癌细胞SGC-7901分为对照组、0.125 μg/ml组、0.250 μg/ml组、0.500 μg/ml组、1.000 μg/ml组，取对数生长期的人胃腺癌细胞SGC-7901接种于96孔板中，培养24 h后，向每孔加10 μl的药液，每组设定6个平行孔，毒毛旋花子阿洛糖苷浓度分别为0、0.125、0.250、0.500、1.000 μg/ml，置于37 ℃ 5%CO2细胞培养箱中培养，分别在24 h和48 h后，弃上清液，向每孔加100 μl二甲基亚砜(DMSO)，摇床震荡10 min后，酶标仪(Bio-Tek,ELX808IU)检测波长490 nm处吸光度(A)，按公式计算生长抑制率，生长抑制率(%)=〔1-(实验组均值/对照组均值)〕×100%。

1.4 Hoechst染色检测细胞凋亡 将洁净盖玻片置于6孔板内，种入细胞培养过夜，孔中细胞50%～80%时，加入毒毛旋花子阿洛糖苷，浓度为0.500 μg/ml，24 h后，弃培养基，加0.5 ml固定液固定10 min，去固定液，用PBS洗涤2次，弃上清液，加入0.5 ml Hoechst 33258染色液染色5 min，去染色液，用PBS洗涤2次，将盖玻片盖到滴有抗荧光淬灭封片液的载玻片上，于荧光显微镜下观察。对比观察对照组、0.500 μg/ml组的染色结果。

1.5 Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)流式细胞术检测细胞凋亡 对照组、0.125 μg/ml组、0.250 μg/ml组、0.500 μg/ml组，取对数生长期的胃腺癌细胞SGC-7901接种于6孔板中，培养24 h，加药处理24 h后，收集细胞，用预冷PBS洗涤2次，用195 μl的Annexin V-FITC结合液重悬细胞后，加5 μl的Annexin V-FITC，室温避光孵育10 min，1 000×g离心5 min，弃上清液，用190 μl的Annexin V-FITC结合液重悬细胞后，加10 μl PI染色液，轻轻混匀，避光4 ℃孵育5 min。然后用流式细胞仪检测总相对死亡率。

1.6 JC-1法检测线粒体膜电位 对照组、0.125 μg/ml组、0.250 μg/ml组、0.500 μg/ml组，取对数生长期的胃腺癌细胞SGC-7901接种于6孔板中，培养24 h，加药处理12 h后，弃培养基，用预冷PBS洗涤1次，弃PBS，每孔加1 ml的细胞培养液和1 ml的JC-1染色工作液，混匀于37 ℃ 5%CO2细胞培养箱中培养20 min。然后弃上清液，用JC-1染色缓冲液洗涤2次，弃上清液，加2 ml细胞培养液于荧光显微镜下观察。

1.7 Western blotting 法检测线粒体蛋白表达 线粒体蛋白的提取使用细胞线粒体分离试剂盒，收集0.500 μg/ml组的细胞，用PBS洗涤2次，弃PBS，向细胞沉淀里添加已加入苯甲基磺酰氟(PMSF)的线粒体分离试剂，重悬后把细胞悬浮液转移到适当大小的玻璃匀浆器中，匀浆30下，600×g，4 ℃离心10 min，把上清液转移到另一离心管，11 000×g，4 ℃离心10 min，沉淀即为细胞线粒体，加线粒体裂解液得线粒体蛋白，同时上清液12 000×g，4 ℃离心10 min，取上清液为细胞质蛋白。用考马斯亮蓝法(Bradford法)测定蛋白表达，以60 μg的上样量对蛋白进行变性，用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液下进行蛋白分离，细胞色素C抗体按1∶200一抗稀释液稀释，一抗Caspase-3抗体按1∶250一抗稀释液稀释，Caspase-9、COX Ⅳ、Actin抗体均按1∶1 000一抗稀释液稀释，用辣根过氧化物酶标记二抗(1∶1 000)封闭，用增强型化学免疫印迹检测系统(ECL)检测免疫反应蛋白。

2 结果

2.1 不同组胃腺癌细胞SGC-7901 A值、生长抑制率比较 MTT法结果显示，24 h和48 h时不同组胃腺癌细胞SGC-7901 A值、生长抑制率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；其中24 h和48 h时，0.125 μg/ml组、0.250 μg/ml组、0.500 μg/ml组、1.000 μg/ml组较对照组胃腺癌细胞SGC-7901 A值降低、生长抑制率升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；0.250 μg/ml组、0.500 μg/ml组、1.000 μg/ml组较0.125 μg/ml组胃腺癌细胞SGC-7901 A值降低、生长抑制率升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；0.500 μg/ml组、1.000 μg/ml组较0.250 μg/ml组胃腺癌细胞SGC-7901 A值降低、生长抑制率升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；1.000 μg/ml组较0.500 μg/ml组胃腺癌细胞SGC-7901 A值降低、生长抑制率升高，差异均有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.2 细胞凋亡情况 细胞发生凋亡时，因为染色质固缩，Hoechst 染色表现为细胞核呈紧密较亮荧光体并且颜色变白。在荧光显微镜下观察发现，对照组细胞核显示为蓝荧光且较均匀，0.500 μg/ml组处理12 h后细胞核呈紧密较亮荧光体，颜色较白(见图1)。处理24 h后流式细胞术检测细胞凋亡情况，采用Annexin V-FITC和PI染色后，正常的活细胞不被Annexin V-FITC和PI染色(左下角)；凋亡早期的细胞仅被Annexin V-FITC染色，PI染色呈阴性(右下角)；坏死细胞和凋亡晚期的细胞可以同时被Annexin V-FITC和PI染色(右上角)。左上角出现的是许可范围内的检测误差(见图2)。不同组胃腺癌细胞SGC-7901总相对死亡率比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中，0.125 μg/ml组、0.250 μg/ml组、0.500 μg/ml组较对照组胃腺癌细胞SGC-7901 总相对死亡率升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；0.250 μg/ml组、0.500 μg/ml组较0.125 μg/ml组胃腺癌细胞SGC-7901总相对死亡率升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；0.500 μg/ml组较0.250 μg/ml组胃腺癌细胞SGC-7901总相对死亡率升高，差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

图1 荧光显微镜下观察细胞凋亡情况(Hoechst染色，×200)

Figure 1 The cell apoptosis under the fluorescence microscope

Table 1 Comparison of value A and rate of growth inhibition of human gastric cancer cells type SGC-7901 among different groups at 24 h and 48 h after treatment

组别 24hA值 生长抑制率(%) 48hA值 生长抑制率(%)对照组0920±0027000±0000975±0034000±0000125μg/ml组0855±0029∗706±315∗0890±0056∗871±580∗0250μg/ml组0782±0015∗△1500±160∗△0747±0040∗△2338±423∗△0500μg/ml组0675±0009∗△▲2663±102∗△▲0356±0012∗△▲6256±131∗△▲1000μg/ml组0465±0005∗△▲☆4946±050∗△▲☆0104±0005∗△▲☆8933±057∗△▲☆F值791886091016710475P值<0001<0001<0001<0001

注：A=吸光度；与对照组比较，*P<0.05；与0.125 μg/ml组比较，△P<0.05；与0.250 μg/ml组比较，▲P<0.05；与0.500 μg/ml组比较，☆P<0.05

Table 2 Comparison of total relative mortality of gastric adenocarcinoma cells type SGC-7901 among different groups

组别总相对死亡率(%)对照组0000±0000125μg/ml组812±154∗0250μg/ml组1125±243∗△0500μg/ml组6024±1079∗△▲F值11102P值<0001

注：与对照组比较，*P<0.05；与0.125 μg/ml组比较，△P<0.05;与0.250 μg/ml组比较,▲P<0.05

注：PI=碘化丙啶

图2 不同组Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡情况

Figure 2 Detection of cell apoptosis in different groups using Annexin V-FITC/PI flow cytometry

2.3 线粒体膜电位改变 JC-1染色结果显示，毒毛旋花子阿洛糖苷处理胃腺癌细胞SGC-7901 12 h后，0.125 μg/ml组、0.250 μg/ml组、0.500 μg/ml组显示绿色荧光，随毒毛旋花子阿洛糖苷浓度的增加绿色荧光增强(见图3)。

2.4 Western blotting法检测线粒体蛋白表达 分别提取毒毛旋花子阿洛糖苷(0.500 μg/ml)处理不同时间点的线粒体蛋白和细胞质蛋白，检测细胞色素C、Caspase-3和Caspase-9的表达，结果显示，随着细胞凋亡的发生，细胞色素C从线粒体中释放到细胞质中，同时，Caspase-3和Caspase-9也被激活并发生剪切活化，活化片段表达增加(见图4)。

3 讨论

胃癌是严重危害人们健康和生命的恶性肿瘤之一，在我国其发病率居各类肿瘤的首位[9]。肿瘤的发生、发展与细胞凋亡密切相关。目前许多抗肿瘤的化疗药物主要通过诱导其凋亡来杀伤肿瘤细胞。

细胞凋亡是十分复杂的过程，是由基因精确调控的程序性死亡方式，尽管促进凋亡的具体信号途径尚未完全清楚，但是一些诱导分子最终均通过活化一系列被称为半胱氨酸蛋白酶的信号分子参与的共同通路来诱导凋亡过程，从而最终导致DNA断裂以及与凋亡相关的形态学改变[10-11]。目前,已知两种信号途径可以诱导细胞凋亡发生[12-15]：第一途径即外部信号途径亦称死亡受体途径，主要由Fas(CD95)死亡受体或其他肿瘤坏死因子α(TNF-α)受体超家族成员活化并募集细胞膜旁的Caspase (主要为Caspase-8)，然后活化Caspase-3，后者促进细胞凋亡；第二种途径指内部途径或称线粒体途径，其特点是线粒体级联反应导致细胞色素C释放，活化Caspase-9，并形成凋亡小体及多蛋白复合物，进而活化下游Caspase-3，放大死亡信号，诱导细胞凋亡。可见两种途径分别特异性活化Caspase-8或Caspase-9，两种途径最后均活化Caspase-3，导致细胞凋亡。近年来人们对凋亡的认识已经从细胞核的改变决定凋亡发展为重视线粒体，因为其构成了细胞存亡的控制中心。凋亡过程中线粒体呼吸链电子传递中断，自由基产生，能量供应受阻。在检测到经典的细胞凋亡特征以前，线粒体膜完整性就已发生了重大变化，这些变化涉及线粒体内膜和外膜的改变，包括内膜跨膜电位的丧失和蛋白质通过外膜的释放[16]。

图3 JC-1法检测线粒体膜电位变化(JC-1染色，×200)

注：Cyto-C=细胞色素C，COX Ⅳ=环氧酶Ⅳ，Actin=肌动蛋白

图4 Western blotting法检测细胞色素C、Caspase-3 和Caspase-9的表达

Figure 4 Detection of expressions of cytochrome C,Caspase-3 and Caspase-9 by Western blotting analysis

强心苷类化合物已经越来越多地应用于各种肿瘤的防治研究中,能通过多种途径在体内、外发挥抗肿瘤作用。毒毛旋花子阿洛糖苷是强心苷的一种。本实验结果发现，毒毛旋花子阿洛糖苷处理胃腺癌细胞SGC-7901能够明显抑制其生长和增殖，并能有效诱导细胞凋亡，这种抑制作用具有时间和剂量依赖性，随着时间及药物浓度的增加，细胞生长抑制率呈递增趋势。用JC-1染色检测发现毒毛旋花子阿洛糖苷处理胃腺癌细胞SGC-7901线粒体膜电位明显下降的同时，线粒体细胞色素C也逐渐下降，但细胞质细胞色素C的表达则明显增加，说明细胞色素C从线粒体释放到细胞质中。另外，实验结果还发现，毒毛旋花子阿洛糖苷处理胃腺癌细胞SGC-7901后，Caspase-9和Caspase-3也活化，从而激活Caspase凋亡途径，最终诱导细胞凋亡。这些结果说明，毒毛旋花子阿洛糖苷可以通过线粒体途径诱导人胃腺癌SGC-7901细胞凋亡，是一种潜在的肿瘤治疗的有效药物。由于强心苷在大剂量应用时具有心脏毒性,故安全性问题成为其投入抗癌临床应用的最大障碍。近期有报道通过对化合物结构的优化，可以降低其毒性，同时保留抗肿瘤活性[8]，因此通过结构优化把毒毛旋花子阿洛糖苷的抗肿瘤活性控制在非毒性范围内是一个亟待解决的问题。

[1]Gheorghiade M.Digoxin therapy in chronic heart failure [J].Cardiovasc Drugs Ther,1997,11(Suppl 1):279-283.

[2]Dai HF,Gan YJ,Que DM,et al.Two new cytotoxic cardenolides from the latex of Antiaris toxicaria [J].J Asian Nat Prod Res,2009,11(9):832-837.

[3]Mei WL,Gan YJ,Que DM,et al.Study on the chemical constituents from the latex of antiaris toxicaria[J].Chinese Journal of Organic Chemistry,2011,31(4):533-537.(in Chinese) 梅文莉,干玉娟,阙东枚,等.见血封喉乳汁中的化学成分研究 [J].有机化学,2011,31(4):533-537.

[4]Que DM,Mei WL,Dai HF.Cytotoxic cardenolides from the latex of antiaris toxicaria[J].Journal of Tropical and Subtropcal Botany,2010,18(4):440-444.(in Chinese) 阙东枚,梅文莉,戴好富.见血封喉乳汁中具有细胞毒活性的强心苷[J].热带亚热带植物学报,2010,18(4):440-444.

[5]Dong WH,Mei WL,Zeng YB,et al.Cardenolides from the seeds of antiaris toxicaria and their cytotoxicity[J].Journal of Tropical and Subtropcal Botany,2011，19(2):171-176.(in Chinese) 董文化,梅文莉,曾艳波,等.见血封喉种子强心苷类化合物及其细胞毒活性[J].热带亚热带植物学报，2011，19(2):171-176.

[6]Packer M,Cohn JN.Consensus recommendations for the management of chronic heart failure.On behalf of the membership of the advisory council to improve outcomes nationwide in heart failure [J].Am J Cardiol,1999,83(2A):1A-38.

[7]Guo JL,Zheng SJ,Li YN,et al.Toxicarioside A inhibits SGC-7901 proliferation,migration and invasion via NF-κB/bFGF signaling [J].World J Gastroenterol,2012,18(14):1602-1609.

[8]Juncker T,Cerella C,Teiten MH,et al.UNBS1450,a steroid cardiac glycoside inducing apoptotic cell death in human leukemia cell [J].Biochem Pharmacol,2011,81(1):13-23.

[9]Sun XD,Mu R,Zhou YS,et al.Analysis of mortality rate of stomach cancer and its trend in twenty years in China [J].Chinese Journal of Oncology,2004,26 (1):4-9.(in Chinese) 孙秀娣，牧人,周有尚，等.中国胃癌死亡率20年变化情况分析及其发展趋势预测[J].中华肿瘤杂志,2004,26 (1):4-9.[10]Yaguchi T,Fujikawa H,Nishizaki T.Linoleic acide derivative DCP-LA protects neurons from oxidative stress-induced apoptosis by inhbiting activation of caspase-3/-9 [J].Neurochemi Res,2010,35(5):712-717.

[11]Peter ME,Heufelder AE,Hengartner MO,et al.Advances in apoptosis research [J].Proc Natl Acad Sci U S A,1997,94(24):12736-12737.

[12]Ashkenazi A,Dixit VM.Death receptor:signaling and modulation [J].Science,1998,281(5381):1305-1308.

[13]Crow MT,Mani K,Nam YJ,et al.The mitochondrial death pathway and cardiac myocyte apoptosis [J].Circ Res,2004,95(10)：957-970.

[14]Ma X,Zhang LH,Wang LR,et al.Single-walled carbon nanotubes alter cytochrome c electron transfer and modulate mitochondrial function [J].ACS Nano,2012,6(12):10486-10496.

[15]Jiang X,Wang X.Cytochrome C-mediated apoptosis [J].Annu Rev Biochem,2004,73:87-106.

[16]Norberg E,Orrenius S,Zhivotovsky B,et al.Mitochondrial regulation of cell death:processing of apoptosis-inducing factor (AIF) [J].Biochem Biophys Res Commun,2010,396(1):95-100.

(本文编辑：陈素芳)

Apoptosis of Gastric Adenocarcinoma Cells Type SGC-7901 Induced by Strophalloside and Its Mechanism

ZHANGXue-jiao,MEIWen-li,CAICai-hong,etal.

DaliUniversity,Dali671099,China

Objective To explore the apoptosis-inducing effect of Strophalloside on gastric adenocarcinoma cells type SGC-7901 and its mechanism.Methods The human gastric adenocarcinoma cells type SGC-7901 were divided into control group,0.125 μg/ml group,0.250 μg/ml group,0.500 μg/ml group,and 1.000 μg/ml group.The growth inhibition effect of Strophalloside on gastric adenocarcinoma cells type SGC-7901 was detected by MTT assay,and the apoptosis was measured by Annexin V-FITC/PI flow cytometry and Hoechst staining.The changes of mitochondrial membrane potential were examined by JC-1 kit.The expressions of mitochondrial pathway-related protein cytochrome C,Caspase-3 and Caspase-9 were detected by Western blotting analysis.Results According to MTT assay results,there were significant differences in value A and rate of growth inhibition of gastric adenocarcinoma cells type SGC-7901 among different groups at 24 h and 48 h after treatment,respectively (P<0.05);comparison of the above two indicators between groups showed that value A of gastric adenocarcinoma cells type SGC-7901 decreased sequentially,and rate of growth inhibition increased sequentially (P<0.05).By fluorescence microscope,the cell nucleus of control group showed homogeneous blue fluorescence,the cell nucleus of 0.500 μg/ml group showed compact bright fluorescence with white color.There was significant difference in total relative mortality of gastric adenocarcinoma cells type SGC-7901 among different groups (P<0.05);comparison of the above indicator between groups showed that total relative mortality of gastric adenocarcinoma cells type SGC-7901 increased sequentially (P<0.05).According to results of JC-1 staining,gastric adenocarcinoma cells type SGC-7901 showed green fluorescence 12 h after Strophalloside treatment,and fluorescence intensity increased as concentration of Strophalloside rised.According to Western blotting results,cytochrome C was released from mitochondria into cytoplasm C,and Caspase-3 and Caspase-9 were activated,shear and activation occurred,the expression level of activated fragments increased.Conclusion Strophalloside can induce apoptosis of gastric adenocarcinoma cells type SGC-7901 through the mitochondria-mediated pathway.

Stomach neoplasms；Strophanthins；Mitochondria；Apoptosis

国家自然科学基金资助项目(30860345)；国家科技支撑计划课题资助项目(2013BAI11B04)；公益性行业(农业)科研专项(201303117)

671099云南省大理市，大理学院(张雪娇)；中国热带农业科学院热带生物技术研究所(梅文莉，蔡彩虹，董文化，戴好富)；大理学院药物研究所(姜北)；海南医学院海南省热带病重点实验室(黄风迎)

黄风迎，571101海南省海口市，海南医学院海南省热带病重点实验室；E-mail：fyhuang16@126.com

戴好富，570100海南省海口市，中国热带农业科学院热带生物技术研究所；E-mail：daihaofu@itbb.org.cn

R 735.2

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.15.003

2014-06-28；

2015-01-06)