人羊膜间充质细胞的分离培养及其生物学特性探讨

丁淑芹 樱川宣男

1 首都医科大学附属北京佑安医院，北京市 100069； 2 日本生物资源应用研究所

在很多组织中，如脐带血、骨髓及外周血等组织中存在多分化功能的干细胞，其在细胞移植及组织工程研究中意义甚大。但由于伦理问题、数量来源及移植后免疫排斥等诸多因素限制其在再生医学领域中的应用。羊膜是隔离胎儿和母体的一种隔膜，具有无血管、无神经、无淋巴等特点。由于：（1）剖腹产后的羊膜是废弃物，不涉及伦理道德问题；（2）羊膜取材方便；（3）保障充足的细胞来源；（4）羊膜为低免疫源性器官等特点，在再生医学研究中的意义深远。人羊膜主要由羊膜上皮（amniotic epithelial cells，hAEC）和羊膜间充质（amniotic mesenchymal cells，hAMC）两类细胞组成［1］。至今对于这些细胞的功能了解甚少，本研究利用多种酶消化法从人羊膜中分离出高纯度的hAMC，并对其生物学特性进行了检测，以探讨其在再生医学中的价值。

1 材料和方法

1.1 试剂 DMEM （SIGMA）、青－链霉素混合液（青霉素100U／ml、链霉素100μg／ml）（SIGMA）、Trypsin（SIGMA）、EDTA （DOJIN）、DMEM／F12（SIGMA）、FBS （GIBCO）、2－mercatpethanol（SIGMA）、HEPES buffer（SIGMA）、Recombinant human epidermal growth factor （EGF）（PEPRO－TECH）、Recominant human fibroblast growth factor－basic （bFGF）（PEPROTECH）、Recombinant human leukemia inhibitory factor（LIF）（CHEMICON）、RPMI1640 （sigma，R8758）、agarose（beckman，338400）、兔抗 Musashi 1IgG（abcam）、兔抗Nestin IgG（CHEMICON）、小鼠抗波形蛋白（Vimentin）IgG（SANTA CRUZ）、兔抗Flt－1（C－17）IgG（SANTA CRUZ）、小 鼠 抗 Integrin β1IgG（CHEMICON）、小鼠抗肝细胞核因子（HNF3β、4α、1α）IgG （CHEMICON）、小 鼠 抗 C／EBPαIgG（CHEMICON）、小鼠抗白蛋白（Albumin）IgG（Apllygen）、小 鼠 抗 A1－抗 胰 蛋 白 酶 IgG（AAT）（CHEMICON）、Alexa Fluor rabbit 488（Molecular probe，A－11034）、Alexa Fluor mouse 568（Molecular probe，A－11031）、Human MHC ClassⅡ（Ancell）、Human MHC ClassⅠ（Ancell）。

1.2 方法

1.2.1 hAMC分离。无菌条件下取孕期38～40周剖腹产后的羊膜，用PBS（－）溶液反复冲洗，切成小块，经 Trypsin－EDTA（PBS 中加入4%Trypsin和1%EDTA）反复处理后，先提取hAEC，剩余的羊膜放入Enzyme溶液（DMEM 培养液加1mg／ml Collagenase、10%DispaseⅡ、0.1mg／ml DNaseⅠ）中，37℃，60min进行消化。羊膜溶化液用细胞筛过滤后，1500r／min离心，5min，去上清，AMC培养液［DMEM／F12（1∶1mixture），10%FBS，1.4%2－Mercaptoethanol，0.01μg／ml EGF stock，0.01μg／ml bFGF，0.1%LIF，加青链霉素］混悬细胞，滤器过滤制成细胞悬液，苔盼蓝染色后计数，以1×104／cm2数接种于培养皿或培养瓶中。

1.2.2 细胞培养。AMC培养液，在37℃，5%CO2下进行培养，2～3d后细胞黏附在培养皿底面，更换培养液，以清除未贴壁细胞。显微镜下观察其生长情况，每3d换液，细胞长满后用Trypsin－EDTA消化进行传代培养。每次传代时计数细胞数，画细胞增殖曲线。

1.2.3 免疫细胞鉴定。hAMC细胞（1×104数）培养在24孔培养板内，在37℃，5%CO2下培养24h。3.7%多聚甲醛固定，鼠抗人Vimentin 1抗（1∶50），37℃反应1h，PBS洗3次，加FITC标记羊抗鼠2抗（1∶500），37℃反应1h，PBS洗3次，封片后荧光显微镜观察。其他一抗均1∶50稀释，二抗1∶500稀释，方法同上。用荧光激活细胞仪分离法（Fluorescent activated cell sorting，FACS）分析人MHC Class分子。方法：培养中的hAMC用胰酶消化后回收至离心管，离心后去除上清液。用HBSS培养液作悬浮液，并进行细胞计数。将密度1×106／ml细胞悬浮液分装入2ml的离心管，加入分别稀释1∶100后的人MHC ClassⅡ和MHC ClassⅠ一抗，在4℃条件下反应1h，加2ml HBSS培养液洗2次。加入相应的荧光标记的二抗（1∶500稀释），再在4℃条件下反应30min。用HBSS培养液洗3次后进行检测。

1.2.4 癌化实验。35mm培养皿，培养液分3层，底层：0.7%agarose／RPMI 1640，中间层：0.5%的agarose／RPMI 1640和1×104细胞混合液（10%FBS），上层：1ml RPMI 1640（10%FBS）。在37℃，5%CO2下进行培养，HeLa细胞做阳性对照，0、1和2周分别进行观察和拍照。

2 结果

2.1 hAMC生长特性 原代培养细胞24h内开始贴壁，2～3d后观察细胞呈现梭形或星形形态，此时贴壁细胞呈单个分散或几个细胞的克隆，贴壁3d后生长迅速，8d左右形成单层，细胞融合成片，细胞形态逐渐均匀，成细长的梭形，轮廓清晰，胞核清晰可见（见图1）。传代后细胞24h内完全贴壁，3～4d后生长增殖速度明显加快，6d左右完全融合，体外培养10代以后，部分细胞的增殖速度明显减慢，并发生形态变化，变得宽大扁平，失去增殖和分化能力，但多数细胞仍然维持细长的梭形，保持增生和分化能力（见图2）。

图1 hAMC细胞形态（A：10×；B：20×；bar＝100μm）

图2 hAMC的增值曲线

2.2 免疫细胞化学检查 利用Vimentin和Flt－1抗体进行免疫双重染色，神经发生相关蛋白Vimentin主要在细胞质中表达，而血管内皮生长因子受体Flt－1主要表达在细胞核中（见图3），利用同样的方法对各种与神经、肝脏发生相关的部分因子进行检测，见表1。

2.3 免疫源性检测 人羊膜为一种低免疫原性组织，适合同种异体移植治疗。FACS检测结果表明hAMC的MHC ClassⅡ为完全阴性，MHC ClassⅠ为弱阳性（见图4）。

2.4 癌化实验 HeLa细胞随着培养时间的延长，增殖迅速，1周时肉眼可见细胞集落成团，2周时其细胞集落成团明显增大；而hAMC未见细胞集落成团现象，保持单个生长，1周时细胞数量变化不大，2周时细胞数量逐渐减少，体外实验提示hAMC传代培养时保持细胞原有的特性，不具有致瘤性（见图5）。

图3 hAMC的免疫染色像（A为位相差；B为Vimentin；C为Flt－1；D为Vimentin和Flt－1合图）

表1 免疫细胞化学检测结果

图4 MHC ClassⅠ／Ⅱ的FACS检测结果［A：对照组IgG（虚线）和anti－MHC ClassⅡIgG （实线）；B：对照组（实线）和 MHC ClassⅠ（虚线）］

图5 浮游条件下的癌化实验hAMC和HeLa培养后0、1、2周时的图像（10×，bar＝100μm）

3 讨论

本研究利用多种酶消化法，从羊膜中分离高纯度的hAMC。一般认为间充质细胞是具有高度的自我复制能力并具备多分化潜能的干细胞，但至今无特异性标记来确认其存在。本研究结果表明，hAMC原代培养24h内开始贴壁，72h内细胞呈现梭形或星形形态，此时贴壁细胞呈单个分散或几个细胞的克隆，贴壁3d后生长迅速，细胞数量成倍增加，提示hAMC具有较强的贴壁性和自我复制能力，并在多种细胞因子的培养环境下，可传代培养10代以上。

樱川等证实hAMC表达Musashi和Nestin mRNA，有66%～88%的细胞为Brdu阳性细胞，同时存在分化的β－tubulin和NF－M 阳性细胞，提示hAMC的增殖活性和分化潜能，证实hAMC中存在神经胶质前体细胞的表型［2］。Musashi－1蛋白是一种RNA连接蛋白，在哺乳动物胚胎和成体神经干细胞中表达丰富［3，4］，其主要功能是调控外胚层前体细胞的不对称分裂，有助于神经干细胞的自我复制［5］。Nestin又称神经上皮干细胞蛋白，是中枢神经系统主要的中间丝蛋白，表达于发育中的中枢神经系统和骨骼肌，功能与维持神经前体细胞形态结构有关。波形蛋白（Vimentin）是中间丝蛋白的一种，在神经系统发育中的表达有一定的时间性，主要表达于尚未发生终末分化并保留分化潜能的神经祖细胞。Vimentin阳性细胞存在于胚胎及成年哺乳动物的脑室系统和嗅球、海马和纹状体等部位［6］。hAMC表达Musashi、Nestin和Vimentin等神经干细胞特异性标记蛋白，由此考虑该细胞具备在一定的条件下诱导分化为神经细胞的潜能。已有报道来源于hAMC的神经前体细胞可用于治疗帕金森氏病、神经代谢性疾病及脑肿瘤等中枢性神经系统疾病［7，8］，这些均支持hAMC分化为神经细胞的结果。

肝窦内皮细胞（Sinusoidal endothelial cell，SEC）表达两种血管内皮细胞生长因子（VEGF）的受体（Flt－1和 KDR／Flk－1），肝脏受损伤后，肝细胞、SEC等细胞分泌、表达VEGF增加，而VEGF介导了SEC的增殖反应［9］。Flt－1含有细胞内的酪氨酸激酶区，不仅可刺激SEC的增殖，而且能诱导SEC细胞的管道生成［10］。正常肝脏组织中还有整合素（Integrinβ1）的表达。肝细胞核因子（HNF）是肝脏发生相关的转录因子［11，12］，表明 HNF3β对肝脏的发育和肝干细胞的分化也可能有重要作用，3β在肝脏发生早期表达，并直接促进AAT的表达。4α对肝干细胞分化为肝细胞及肝脏代谢调节等功能起重要作用，4α基因缺失导致异常肝细胞形成，4α促进1α表达，也与3β一起促进AAT的表达。1α是肝特异性基因如白蛋白、α1抗胰蛋白酶、α和β纤维蛋白原的转录激活子，可能与维持肝干细胞处于分化状态有关；1α在肝脏发生后期表达，参与AAT和Albumin的表达。C／EBPα也是与肝脏发生相关的转录因子，是细胞合成和积累糖原的必需蛋白质。hAMC表达C／EBPα，说明hAMC有可能具备合成和储备糖原的能力。羊水中有AAT和Albumin等蛋白质成分，由于hAMC表达肝实质细胞的标志物Albumin和A1－抗胰蛋白酶（AAT），还有组成羊膜的另一种细胞hAEC也表达Albumin和AAT［13］以及羊膜围绕羊水的结构等，可推定羊水中的Albumin和AAT为羊膜细胞所分泌。Albumin和AAT在羊水中能形成稳定的渗透压，清除有害蛋白质，保护胎儿。总之，根据hAMC 表达 Flt－1、Integrinβ1、HNF、Albumin和AAT等事实，可以推定在适合条件下可以诱导转化为成熟的肝细胞。本课题组已证明在一定条件下hAMC可分化为类似人类肝脏细胞的细胞（尚未报告）。hAMC具有糖原合成和储备及分泌Albumin和AAT功能，也许有助于肝功能障碍及肝脏移植之前的延命措施。

关于羊膜细胞的低免疫源性和羊膜组织移植不易引起免疫排斥反应的事实曾多次被报道［14］。本研究结果也证实hAMC表面不表达主要组织相容性复合体Ⅱ（MHC ClassⅡ），MHC ClassⅠ为弱阳性，前期的流式细胞仪分析也支持相同结果。克服移植后的免疫排斥反应是一种难题，羊膜细胞的低免疫原性特点对于再生医学领域中的意义重大。由于干细胞具备长时间持续增生的能力，体内移植后可导致肿瘤，也是限制其临床应用的重要原因之一。本研究结果表明，hAMC在体外癌化实验中不引起癌化，不具有致瘤性，从此推定在细胞移植研究中hAMC可作为较理想的材料来源。至于hAMC移植后是否引起体内致瘤等问题尚待探讨。

总之hAMC为具有多分化潜能的干细胞，其来源充足，具有低免疫源性、自我复制能力强、不涉及伦理问题及无致瘤性等特点，从此在再生医学研究领域中可作为新的移植细胞来源。hAMC的多分化潜能的细节有待于进一步探讨。

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