不同酵母对苹果啤酒发酵及风味的影响

韩 东,李 红,景建洲

(1.郑州轻工业学院 食品与生物工程学院,河南郑州 450002;2.中国食品发酵工业研究院,北京 100015;3.中德发酵酒品质与安全国际联合研究中心,北京 100015)

不同酵母对苹果啤酒发酵及风味的影响

韩 东1,2,3,李 红2,3,景建洲1,*

(1.郑州轻工业学院 食品与生物工程学院,河南郑州 450002;2.中国食品发酵工业研究院,北京 100015;3.中德发酵酒品质与安全国际联合研究中心,北京 100015)

在同种工艺条件下,以实验室保藏的5株酿酒酵母(A、B、C、D和E)及欧洲进口的5株活性干酵母(S04、S23、S33、S189和安琪)为出发菌,测定了发酵过程中发酵速度、α-氨基氮(α-AN)、主酵结束后风味物质、有机酸和可发酵性糖等指标,并系统地比较了不同酵母的发酵性能和风味。结果显示,菌株S23发酵速度较快,发酵液中高级醇、乙酸和可发酵性糖的含量较低,分别为56.12 mg/L、62.86 mg/L和0.62 mg/L,柠檬酸的含量较高为194.46 mg/L。研究表明菌株S23的综合性能最佳,具有应用于苹果啤酒生产的潜能。

酿酒酵母,发酵性能,风味物质

啤酒是一种低酒精度饮品,深受消费者喜爱。但是,近些年来啤酒市场的竞争日益激烈,消费者的口味也趋于多元化,因而用于酿酒的原辅料越来越丰富。其中以苹果汁为辅料生产的苹果啤酒就是一款新兴的啤酒产品。现在研究发现,苹果汁中含有大量的维生素、氨基酸和矿物质,具有很高的营养价值[1]。故将苹果汁与麦汁混合发酵生产出既能保持啤酒的固有风格,又能突出苹果的独特口味的具有一定营养保健功能的苹果啤酒[2],是消费者要求啤酒“低浓度、低酒精、功能性、果味型发展”的必然需要,对推动我国果品产业化及饮料酒市场、特别是低度酒市场的发展具有重要意义[3]。因此开发成本低廉,资源、营养丰富的苹果啤酒势在必行。

酿酒酵母是影响苹果啤酒品质的重要因素之一,其选择直接影响了苹果啤酒的质量[4-6]。郑莉烨等研究了四种具有不同遗传背景的下面酵母(Saccharomycespastorianus,FBY0095、FBY0096、FBY0097和FBY0098)在12°P正常浓度与24°P超高浓度麦汁中发酵性能的差异,结果表明,正常浓度发酵条件下,啤酒酵母FBY0095和FBY0098具有良好的发酵特性;而超高浓度条件下,啤酒酵母FBY0097和FBY0098表现出了较好的发酵性能[7]。严红光等利用顶空固相微萃取结合气质联用仪分析3种酵母菌酿造的蓝莓酒中主要香气物质,研究结果显示酵母菌种是影响果酒香气物质组成的关键因素之一[8]。Williams等用苹果酒酵母发酵无菌糖溶液,得到的发酵液中含有一系列的醇类、醛类和酯类,其中大部分都能在同种酵母发酵的苹果酒中找到[9]。Pollard用苹果汁比较了人工酵母(Port350R)发酵的苹果酒和天然酵母发酵的苹果酒中高级醇含量,发现天然酵母发酵的苹果酒所产的高级醇、2-苯乙醇含量均比人工酵母发酵的苹果酒高[10]。上述主要研究了酵母的性能及产香特性。这是由于不同的酵母菌株有着不同的生理特性,其代谢副产物的种类及含量均有差异的缘故。

目前,我国苹果啤酒的发展起步较晚,对苹果啤酒酵母的研究较少,主要通过从自然中初步分离筛选出发酵性能较好的苹果啤酒酵母。然而,这些酵母发酵性能的不足,尚不能适应商业化生产。本研究针对10株酿酒酵母的发酵性能、产酒理化性质和主要风味成分进行系统研究,筛选出适宜苹果啤酒酿造的酿酒酵母,旨在推动饮料酒产业的发展,同时为构建特色型苹果啤酒酵母提供优良亲本。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)A、B、C、D和E 中国食品发酵工业研究院提供;S04和S33 ALE酵母、S23和S189 LARGER酵母 欧洲进口活性干酵母;安琪果酒酵母 安琪酵母有限公司;大麦芽(澳麦) 燕京啤酒有限公司提供;苹果浓缩汁 烟台金潮食品有限公司提供;无水葡萄糖(纯度99.8%) 美国sigma公司;D-果糖、蔗糖(纯度99.5%) Biotopped公司;麦芽糖、麦芽三糖(HPLC) 美国sigma公司;乙腈(色谱纯);柠檬酸、草酸、苹果酸、琥珀酸、乳酸、富马酸(均为色谱纯) 美国Sigma公司;乙醛、DMS、甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸异丁酯、正丙醇、异丁醇、乙酸异戊酯、异戊醇、己酸乙酯、辛酸乙酯(纯度均≥95.0%) Acros公司和Sigma-Aldrich公司。

高效液相色谱仪 日本岛津公司;气相色谱仪 美国PerkinElmer公司;ICS-3000型离子色谱 美国戴安公司;KQ100-DE超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;万分之一天平 日本岛津公司;低温恒温水浴锅 杭州雪中炭恒温技术有限公司;LRH-250生化培养箱 上海一恒科技有限公司;UV1780 紫外可见分光光度计 日本岛津公司;PHS-3C pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程

1.2.2 菌株活化 实验室酵母的活化:取1环斜面酵母转接到麦汁斜面培养基上,30 ℃培养24 h;干酵母的活化:取约1 g干酵母,用20 mL 5%糖水30 ℃活化30 min。

1.2.3 酵母扩大培养 酵母的一级扩大培养:将活化菌种转接于10 mL液体麦汁培养基中,在30 ℃下一级扩大培养24 h。

酵母的二级扩大培养:再转接于100 mL液体麦汁培养基中,在30 ℃下扩大培养24 h。通过血球计数板对酵母读数,直至菌体浓度达到107个/mL以上,作为种子液备用。

1.2.4 酵母发酵力实验 按10%的比例,将扩大培养的酵母分别接入到100 mL麦汁和苹果汁混合液(麦汁∶苹果汁=7∶3)中[11],10 ℃发酵,每24 h称重,至2次失重之差小于0.2 g为发酵终点。绘制发酵醪失重与时间曲线,比较各酵母发酵速度的大小[12]。

1.2.5 理化指标测定 酒精度以密度瓶法测定,参照GB/T 4928-2008;总酸利用指示剂法测定,参照GB/T 4928-2008;α-氨基氮利用比色法测定,参照GB/T 1686-2008;总糖利用蒽酮比色法测定[13-14]。

1.2.6 风味物质测定 待测样品在超声波仪器里超声脱气30 min,测试样品需在室温下平衡后,取样品5 mL注入进样瓶中,放入自动进样盘中。发酵液样品直接进样进行风味物质[15]含量的测定。

1.2.7 有机酸测定 样品液超声脱气后,用移液管移取1.0 mL,用超纯水稀释至10.0 mL并摇匀,用过滤器过滤后作为试液。分别取样品液3.0～5.0 mL注入进样瓶中,通过自动进样盘直接进样,根据保留时间定性,用峰面积按外标法定量。

1.2.8 可发酵性糖测定 待测发酵液样品在超声波条件下脱气30 min,测试样品需在室温下平衡,取样品1 mL,经0.45 μm微孔膜过滤器注入离心管中。发酵液样品直接进样进行葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖和麦芽三糖含量的测定[16],以上各实验的进样量均为5 μL。

2 结果与分析

2.1 不同酵母发酵性能的对比

2.1.1 酵母菌株发酵力实验 酵母菌的发酵力是反映酵母对各种糖类的发酵能力的重要指标。酵母的酶系不同,发酵糖的能力也不同,发酵过程中除产生乙醇外,还伴有二氧化碳形成;形成的二氧化碳从发酵体系中逸出,使整个体系的重量减轻,根据减轻的程度,可以判断发酵速度的快慢;在酿酒工业中,酵母菌的产酒能力要求较高,因此发酵力也就成为衡量酵母产酒能力的一个重要指标[17]。

酵母菌株发酵力测定结果见图1A和图1B。从图1A中可以发现:A和D发酵力比B、C、E发酵力强,并且在第3 d时CO2失重量达到了最大值,具有较强的发酵性能;从图1B中可以看出:5种活性干酵母起酵较快,其中S04和S23发酵速度比S33、S189和安琪发酵快,具有较好的发酵力。因此,不同酵母菌株在相同浓度麦汁中的发酵性能有显著差异,这是因为不同的菌株其遗传背景不同的缘故。

图1 不同酵母菌株发酵速度的比较Fig.1 The comparison of different yeaststrains fermentation speed

2.1.2 酵母发酵液的理化指标 我国GB/T4927-2008规定11°P啤酒的酒精度含量不低于3.2%,真正浓度不低于3.9%。从表1可看出,S04、S23和S189酵母酒样均符合规定。就真正发酵度而言,酵母发酵液的发酵度存在显著差异,且相关的研究发现成品酒的发酵度在62%～68%之间时酒样口味协调,香气典型,因此S04、S23和S33酵母酒样较好。由于发酵液是由苹果汁和麦汁混合液发酵而成,因此10株酵母酿造的苹果啤酒总酸含量均高,其中S04酒样显著低于其他。

表1 不同酵母菌株发酵液的理化指标

注:
注:n=3,同列数据尾注不同字母表示在p<0.05时有统计学差异。

2.1.3 酵母菌株发酵过程中α-氨基氮含量的变化 从图2A可以看出:苹果麦汁发酵液中α-氨基氮含量随发酵时间逐渐降低,前4 d下降较快,后4 d趋于平缓。说明前4 d的酵母代谢活动较后4 d旺盛。主酵结束后,α-氨基氮的同化率强弱顺序:C>E>D>A>B,这表明C利用α-氨基氮的能力较强,其活性较高。从图2B可以看出:发酵液中α-氨基氮含量随发酵进行呈下降趋势,其中安琪酵母的α-氨基氮含量下降速度最快,S189下降速度最慢。主酵结束后,α-氨基氮的同化率强弱顺序:安琪>S04>S33>S23>S189,说明安琪酵母的同化率较强,其活性较高。这是由于随着发酵的进行,酵母吸收利用发酵液中的营养物质,发酵前期酵母生长繁殖较快,对营养的需求量大的缘故。

图2 不同酵母菌株发酵过程中α-氨基氮含量的变化Fig.2 The change of alpha amino nitrogen contentof different yeast strains in the fermentation process

2.2 不同酵母对发酵液风味的影响

2.2.1 酵母菌株发酵液风味物质含量对比 发酵酒的风味物质主要来自于原料和发酵过程中酵母的代谢产物[18]。其中高级醇和酯是发酵酒的主要香味和口味物质,能使酒体具有丰满的香味和口味,并增加酒体的协调性。但含量太高会破坏酒体及风味的协调,给酒体带来异香或异杂味。

由图3A可知:菌株E、S189和安琪发酵酒液中乙醛含量均超过界限值10 mg/L[19],会给人以粗糙苦味感。10种不同酵母的发酵酒液中正丙醇、异丁醇和异戊醇的含量均未超过其阈值,其中正丙醇和异丁醇含量差别不明显,而异丁醇的差别显著,酵母S189发酵液中异丁醇的含量最高为64.3 mg/L,酵母S23含量最低为33 mg/L。表明酵母菌株的种类不同,发酵酒中高级醇的含量有不同程度的差异。同时,大量研究结果表明,酵母菌种对啤酒高级醇的形成起决定性作用。

由图3B可知:10种不同酵母的发酵酒液中甲酸乙酯、乙酸异戊酯和己酸乙酯含量符合正常啤酒的范围;菌种S04、S189和安琪发酵酒液中乙酸乙酯含量低于正常啤酒的范围;菌种S23和安琪发酵酒液中辛酸乙酯含量低于正常啤酒的范围。菌种A和E发酵液中甲酸乙酯含量较多;菌种C发酵液中乙酸异戊酯的含量相对较多;菌种D发酵液中己酸乙酯含量较多;整体看A、C和D酵母发酵液酯类含量相差不大,都有增香的作用;活性干酵母S33发酵液中4种酯类含量都很高。这说明A、C、D和S23在产酯类方面有很大的优势。这可能是因为不同菌株细胞内酯酰辅酶A的活性和产量均不同,从而生成的酯的能力也不同。

图3 不同酵母菌株发酵液中风味物质含量对比Fig.3 The comparison of different yeast strainsflavor substances contents in the fermented liquid

由图4可知:菌种E发酵液中总挥发酯含量最多为15.4 mg/L,而菌种S04发酵液中总挥发酯含量最少为6.4 mg/L;菌种E发酵液中总高级醇含量最多为96.3 mg/L,而菌种S23发酵液中总高级醇含量最少为56.1 mg/L。其中菌种E发酵液中总挥发酯和总高级醇含量均是最高的,如果单纯通过醇酯含量对酵母菌株进行比较,分析起来比较困难,因此要进行醇酯比分析。实验室菌种A、C和E发酵液的醇酯比较低,活性干酵母S23发酵液的醇酯比较低,这说明就风味上来说,菌种A、C、E和S23发酵液口感更协调、更纯正。这可能是因为酵母菌株本身之间存在着差异,则不同菌种发酵所得到的风味物质含量有所差异。

图4 不同酵母菌株发酵液中醇酯含量及醇酯比Fig.4 The comparison of alcohol ester content andalcohol ester ratio of different yeast strainsin the fermented liquid

2.2.2 酵母菌株发酵液有机酸含量对比 由图5A和5B可知,发酵液中酵母菌产生的总有机酸范围为1959～1172 mg/L;其中10株酵母菌株发酵液中乙酸含量差别较大,D菌株发酵液含量最低仅为45.8 mg/L,然而S04菌株发酵液含量最高可达到310.2 mg/L,相差近6倍;酵母菌株发酵液中柠檬酸含量差别较小,多数组的含量为190 mg/L左右,S04菌株的含量最低为80.1 mg/L,C菌株的含量最高为110.3 mg/L。这是因为不同酵母菌种在有机酸的代谢能力上差别很大,因此会造成不同酵母品种发酵液中有机酸组成和含量比关系上的区别,进而形成不同的风味类型。

图5 不同酵母菌株发酵液有机酸含量的对比Fig.5 The comparison of organic acids contentof different yeast strains fermented liquid

乙酸含量过高容易造成酒类酸味露头,琥珀酸有特殊的苦味和咸味,致使酒类酸感不协调,而柠檬酸清新爽口,有利于酒类风味的形成。通过比较发现,D酵母产乙酸较少,且发酵液中有利于饮料酒风味的柠檬酸含量较多;同理S23酵母发酵液中柠檬酸含量较多,然而乙酸较少,有利于酸味协调。

2.2.3 酵母菌株发酵液中可发酵性糖含量对比 糖类是酒类酿造过程中非常重要的一类风味物质,因此酵母利用糖类物质的情况,对稳定和控制酒类的质量具有重要意义[20]。由图6可知:主酵结束时,酵母对果糖消耗较大,对麦芽三糖的利用速度较麦芽糖相对缓慢。正常情况下,酵母菌株在发酵的过程中对单糖的利用较为彻底;然而如图6所示:葡萄糖有部分残留,这是由于在发酵过程中,酵母主要利用了苹果汁中的蔗糖,而对果糖、葡萄糖有所积累,在很大程度上改善了苹果麦汁发酵液的口感。从整体上看酵母D可发酵性糖含量较少,说明D酵母对可发酵性糖的利用较彻底;S23酵母可发酵性糖含量较少,说明S23酵母对可发酵性糖的利用较彻底。这是由于酵母菌株的种类不同,其代谢糖的能力也不同,对可发酵性糖的利用能力也不同。

图6 不同酵母菌株发酵液糖含量的对比Fig.6 The comparison of sugar contents ofdifferent yeast strains fermented liquid

3 结论

3.1 十株酵母菌株发酵性能实验结果表明,酵母菌株的发酵力都各有明显差异,其中酵母菌株A和D的发酵力比菌株B、C和E强;活性干酵母S04和S23的发酵力比菌株S33、S189和安琪强。S04和S23酵母发酵所得原酒的酒度、酸度和真正发酵度均符合啤酒国家标准(GB/T4927-2008)。酵母菌株在发酵的过程中,发酵液中α-氨基氮的含量不断减少;主酵结束后,α-氨基氮含量变化趋于平缓,且C酵母和安琪酵母对α-氨基氮的利用率最强。

3.2 不同酵母菌株发酵液风味结果表明,香气物质含量在一定的范围内,酵母菌株的发酵液高级醇含量越低,总挥发酯越高,其发酵酒体协调,香气纯正。根据醇酯比的大小分析发酵酒液,实验室酵母醇酯比普遍低于活性干酵母;活性干酵母S23的醇酯比较低,其发酵酒协调,香醇。有机酸是酒类重要的呈味物质,不同的酵母其发酵液的有机酸含量各有不同。D酵母和S23酵母柠檬酸含量较多,且乙酸含量较少,能够使发酵液具有协调的口感。酵母菌株是通过消耗可发酵性糖来进行发酵,从对糖类的利用情况可以看出:D酵母和S23酵母对可发酵性糖的利用速率较快,其吸收较为彻底。

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Effects of different yeasts on apple beer fermentation and flavor

HAN Dong1,2,3,LI Hong2,3,JING Jian-zhou1,*

(1.School of Food and Bioengineering,Zhengzhou University of Light Industry,Zhengzhou 450002,China;2.China national Research Institute of Food & Fermentation Industries,Beijing 100015,China;3.Sino-Germany United Research Center of Fermented alcohol Quality Safety,Beijing 100015,China)

Under the conditions of same process,five strains ofSaccharomycescerevisiae(A,B,C,D and E)were preserved from the laboratory and five strains of active dry yeasts(S04,S23,S33,S189 and Angel)were imported from the European as the starting bacteria,the speed of fermentation and the contents of α-AN during the fermentation process and flavor substances,organic acids,fermentable sugars after the primary fermentation were studied,and the comparison on fermentation performance and flavors of different yeasts were systematically carried on. The results showed that the strain S23 had the faster fermentation speed,moreover,the contents of higher alcohol,acetic acid and fermentable sugars were lower in the fermented liquid of S23 strains,their contents were 56.12 mg/L,62.86 mg/L and 0.62 mg/L,the more contents of citric acid were 194.46 mg/L. The study were as follows:the strain S23 had the best comprehensive performance,and had the potential in the application of the apple beer production.

Saccharomycescerevisiae;fermentation performance;flavor substances

2014-10-08

韩东(1989-)，男，硕士研究生，研究方向：酿酒技术，E-mail：orange_1101@126.com。

*通讯作者:景建洲(1964-)，男，博士，教授，研究方向：植物基因工程和食品安全检测，E-mail：821952650@qq.com。

国家国际科技合作专项项目(2014DFG31770)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)15-0179-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.030