响应面法优化β-乳球蛋白粗提物自组装VE的工艺条件

刘艳玲，曹玉林，束天锋，解倩倩，吴林昊，胡琪琳，薛秀恒，*

(1.安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽合肥230036;2.安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥230036)

VE又名生育酚，是脂溶性维生素，具有较强的清除自由基作用，在体内外都具有很好的抗氧化作用。同时，VE具有一定的抗衰老、抗癌功能作用，同时还具有延长保存期等［1－2］。但是由于VE是脂溶性物质不溶于水，同时紫外线、碱和氧都能迅速破坏VE，使其难以在食品工业中很好的应用［3－4］。因此，有必要使用特殊的方法对其进行处理，使VE既能保持其固有特性，又能弥补其易氧化和不易用于水溶性产品等不足之处。

食品中脂肪含量的降低，某些脂溶性营养物质随之流失，为了保持脂溶性营养物价值，可以通过以改性乳清蛋白为基质的脂肪替代品来强化某些脂溶性营养物质［5－6］。β－Lg 是乳清蛋白的主要成分，占乳清蛋白的50%［7］，是脂质载体蛋白家族中的一员，β－Lg作为脂质运载蛋白家族的成员，能结合小分子量的疏水性分子，对大量的疏水和两性化合物具有亲合力。研究表明，β－Lg具有三个潜在的配体结合位点，即β－折叠的空穴、β－折叠与α－折叠之间的凹槽内的疏水性口袋表面，以及接近Trp19－Arg124的外侧表面。目前已经有了β－Lg成功结合物质的例子，如 VA、VD、十八碳四烯酸、ω－3聚不饱和脂肪酸等［8－11］，但有关 β－Lg 结合 VE方法的研究一直未见报道。本文利用磁力热激作用以β－Lg粗提物作为VE的载体，制备 β－Lg－VE自组装分子，采用 Box－Behnken 中心组合设计，利用响应面分析法［12－14］建立并优化了β－Lg粗提物结合VE工艺。研究结果对于VE在食品、饮料、保健品等领域的应用具有重要意义。β－Lg与VE均为益于健康的成分，因此该研究具有广阔的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

35%脱盐乳清粉 珠海市澳诚贸易有限公司;VE国药集团化学试剂有限公司;透析袋 国药集团化学试剂有限公司;其他试剂均为分析纯 上海振兴化工一厂;实验用水均为纯水。

TU－1901双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;ZD－85气浴恒温振荡器江苏金坛市金城国胜实验仪器厂;KQ3200DE型数控超声波清洗机 昆山市超生仪器有限公司;DF－101S型集热式恒温加热磁力作用器 巩义市予华仪器有限责任公司;Allegra－64R离心机 合肥华泽生物技术有限公司;TGL－16G离心机 上海安亭科学仪器厂;CP224C电子天平 奥豪斯仪(上海)有限公司;FD－1CE型真空冷冻干燥机 北京天佑科技发展有限公司;QL－901涡旋混合器 江苏海门市麒麟医用仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 VE标准溶液的配制 精确称取0.1 g VE于50 mL小烧杯中，用20 mL无水乙醇溶解，于紫外可见分光光度计扫描，其最大吸收波长为285 nm。进一步稀释得到浓度为 1、2、3、4、5 mg/mL 的标准溶液，用无水乙醇作为空白对照，在285 nm波长处测定吸光度，测定三次，取其平均值。以吸光值(A)对浓度(C)作回归计算，绘制标准曲线。

1.2.2 结合分子中VE的测定 准确称取结合物0.2 g，加入1 mL纯水充分溶解，然后加入 10 mL乙醇放入振荡器中200 r/min振荡提取20 min，用无水硫酸钠除去水分。将溶液离心(3000r/min，10 min)，然后吸取上清液，以乙醇为空白，在285 nm测定吸光值［16］。

式中:C－样品浓度(mg/mL);A－样品的吸光值;B－稀释倍数;V－提取液体积(mL)。

1.2.3 β－Lg粗提物的制备 称取43.6 g硫酸铵于100 mL纯水中，用玻璃棒作用使其溶解，再加入7 g乳清粉，缓慢作用使其溶解。静置0.5 h，离心分离(2000 r/min，15 min)，收集上清液用于下步分离［15］。用截留分子量为3500 u的透析袋近一步分离。最后将透析后的液体用真空冷冻干燥机干燥成粉末用于实验。

1.2.4 β－Lg粗提物结合VE产物的制备 称取一定质量比例的β－Lg粗提物和VE，加入20 mL纯水，涡旋混合30s，混合液在一定温度下的磁力作用条件下反应一段时间，迅速放入冰水浴中冷却，得到反应溶液。将反应溶液放于截留分子量为3500 u的透析袋中，以30倍体积的纯水中静置24 h(避光透析)，去除多余的VE，得到β－Lg粗提物结合VE的产物。将透析后的溶液利用真空冷冻干燥机在－45℃冷冻18 h，得到干燥样品。

1.2.5 单因素实验 按照1.2.4制备结合物，以β－Lg粗提物与VE质量比例、磁力作用时间、热激温度为单因素进行实验，分别考察这三个因素对β－Lg－VE的结合率的影响。

1.2.5.1 β－Lg粗提物与VE质量比例筛选 于磁力作用时间40 min，热激温度80℃，磁力搅拌速度1000 r/min条件下，设置β－Lg粗提物与VE质量比例为 5∶1、10∶1、15∶1、20∶1，研究 β－Lg 粗提物与 VE质量比例对VE结合率的影响。

1.2.5.2 磁力作用时间筛选 于β－Lg粗提物与VE质量比例15∶1，热激温度 80℃，磁力搅拌速度1000 r/min条件下，设置磁力作用时间为10、20、30、40、50、60 min，研究磁力作用时间对 VE结合率的影响。

1.2.5.3 热激温度筛选 于β－Lg粗提物与VE质量比例为15∶1，磁力作用时间50 min，磁力搅拌速度1000 r/min 条件下，设置热激温度为 35、50、60、70、80、90℃，研究热激温度对VE结合率的影响。

1.2.6 响应面分析法实验 根据Box－Behnken中心组合实验设计原理，在单因素考察的基础上，选择β－Lg粗提物与VE质量比例(A)、磁力作用时间(B)和热激温度(C)3个考察因素，每个因素取3水平，分别标记为－1、0、+1，因素与水平编码见表1。

表1 Box－Behnken实验设计因素与水平Table1 Factors and levels of Box－Behnken design

1.2.7 数据统计分析 实验均设3次重复，将得到的实验结果利用Excel、Design－Expert 8.0进行直观分析和方差分析。

2 结果与分析

2.1 VE的标准曲线

由图1可以看出，在测定范围内，VE浓度和吸光值之间呈良好线性关系，线性方程为y=1.3863x+0.0158，相关系数 R2=0.9965。

2.2 单因素实验结果与分析

图1 VE标准曲线Fig.1 The standard curve of VE

2.2.1 β－Lg粗提物与VE质量比例对VE结合率的影响 其他条件一定时，考察β－Lg粗提物与VE质量比例对结合效果的影响。从图可以看出VE的结合率随质量比例的增加而升高，在15∶1～20∶1时VE的结合效果较好，对于β－Lg粗提物的质量过小，则会导致结合物表面VE升高，从而造成结合效果不佳，而β－Lg粗提物的质量过大，造成β－Lg粗提物的浪费，因此选择质量比例为15∶1作为较适条件(图2)。

图2 质量比例对结合率的影响Fig.2 The quality ratio on combined rate

2.2.2 磁力作用时间对VE结合率的影响 其他条件一定时，考察磁力作用时间对结合效果的影响。从图中可以看出磁力作用时间在10～50 min时VE结合率随作用时间的增加而增大，磁力作用时间超过50 min后，作用时间的进一步增加VE的结合率反而有所下降，是因为磁力作用对蛋白有磁化作用，磁化后蛋白结构有利于结合VE，但超过50 min后随着磁力作用时间延长结合率反而下降，在较高温度下过长时间磁力作用对蛋白结合结构造成破坏，使其不利于结合VE。因此最佳磁力作用时间确定为50 min(图3)。

2.2.3 热激温度对VE结合率的影响 其他条件一定时，考察热激温度对结合效果的影响。从图可以看出热激温度在35～70℃时VE结合率随温度的上升而增加，热激温度超过70℃后，温度的进一步增加VE的结合率反而有所下降，可能是因为中性条件下温度升高时，蛋白结构发生变化，具有结合作用的键暴露，单体蛋白之间通过这些基团发生连接聚集，有利于结合VE;而热激温度超过到70℃后，蛋白发生部分聚合，这种聚合作用随加热温度升高而加剧，不利于结合 VE。因而最佳热激温度为70℃(图4)。

图3 磁力作用时间对结合效果的影响Fig.3 The magnetic role time on combined rate

图4 热激温度对结合效果的影响Fig.4 The heat－shock temperature on combined rate

2.3 响应面优化结果分析

Box－Benhnken实验设计及结果见表2，通过软件进行多元回归拟合，得到VE结合率(Y)对编码自变量A、B和C的二次多项回归方程如下:

由表3可以看出，模型的p值＜0.0001，说明该模型显著，失拟项p值为0.4965＞0.05不显著。该模型的相关系数R2为99.1%，调整后为97.94%，说明该模型能解释97.94%的响应值的变化，证明该模型与实际的拟合性较好。

方差分析可知，磁力作用时间对结合率影响显著，质量比例和热激温度对结合率的影响极显著;磁力作用时间与热激温度之间交互作用极显著，其余各因素之间的交互作用均不显著;磁力作用的二次项对得率的影响显著，质量比例和热激温度二次项对得率的影响极显著。由此可以看出，各因素对得率的影响不是简单的线性关系。

各因素的F值表示各因素对响应值的影响程度，F值越大表示该因素对响应值的影响越大。从表3可以看出各因素对得率的影响大小排列分别为质量比例＞热激温度＞磁力作用时间。

由回归方程得出拟合的磁力作用时间与热激温度对结合率的影响的响应面图见图5。图5表示了当质量比例为零水平时，磁力作用时间和热激温度对VE结合率影响。响应曲面的陡峭程度反映了因素对响应值的影响力大小，也表明了因素间交互作用的强弱。由图5可知，磁力作用时间与热激温度之间的交互作用极显著。

表2 Box－Benhnken实验设计及结果Table 2 The design of theBox－Behnken experiment and its results

表3 回归方程方差分析表Table 3 Variance analysis of regression equation

图5 磁力作用时间及热激温度对VE结合率的响应面图Fig.5 Magnetic stirring time and heat－shock temperature on combined rate of response surface

2.4 最佳工艺条件的预测和验证

根据该模型预测出理论条件下β－Lg粗提物结合VE的最佳工艺条件为:质量比例19.39∶1，磁力作用时间48.72 min，热激温度72.5℃，VE结合率为68.98%。考虑到实际生产操作，将最优工艺条件修正为:质量比例19∶1，磁力作用时间49 min，热激温度72℃，经验证此条件下 VE的结合率为(68.5±0.98)%。因此，基于响应面法得到的优化提取工艺参数准确可靠，有实用价值。

3 结论

结合单因素与响应面实验对β－Lg粗提物结合VE的工艺进行了优化，结果表明质量比例、磁力作用时间、热激温度三个因素对VE结合率的影响大小为:质量比例＞热激温度＞磁力作用时间，最佳工艺条件为质量比例19∶1，磁力作用时间49 min，热激温度72℃，此条件下VE结合率高达68.5%。本研究为β－Lg粗提物结合VE提供了科学依据，对VE在食品饮料等领域的应用具有重要意义。

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