发酵方竹笋对复方地芬诺酯诱导小鼠便秘的预防效果

李贵节,王 存,况 刚,陈绍成,熊政委,赵 欣,6,*

(1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.重庆第二师范学院 生物与化学工程系,重庆 400067;3.重庆市功能性食品工程实验室，重庆第二师范学院，重庆 400067；4.重庆市功能性食品协同创新中心，重庆第二师范学院，重庆 400067；5.重庆市功能性食品工程技术中心，重庆第二师范学院，重庆 400067；6.重庆第二师范学院 功能性生态食品研究所,重庆 400067)

发酵方竹笋对复方地芬诺酯诱导小鼠便秘的预防效果

李贵节1,2,3,4,5,6,王 存2,3,4,5,况 刚2,3,4,5,陈绍成2,3,4,5,熊政委2,3,4,5,赵 欣2,3,4,5,6,*

(1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.重庆第二师范学院 生物与化学工程系,重庆 400067;3.重庆市功能性食品工程实验室，重庆第二师范学院，重庆 400067；4.重庆市功能性食品协同创新中心，重庆第二师范学院，重庆 400067；5.重庆市功能性食品工程技术中心，重庆第二师范学院，重庆 400067；6.重庆第二师范学院 功能性生态食品研究所,重庆 400067)

本研究就发酵方竹笋对复方地芬诺酯诱导小鼠便秘的预防效果进行了研究。对发酵方竹笋纤维的观察发现发酵方竹笋比未发酵方竹笋具有更疏松的纤维组织结构,有利于缓解便秘。饲喂发酵方竹笋9 d的便秘小鼠排出首粒黑便的时间低于对照组和方竹笋喂养组,高于正常组和比沙可啶药物治疗组;活性炭在发酵方竹笋喂养组小鼠小肠中推进率高于对照组和方竹笋喂养组,低于正常组和比沙可啶药物治疗组。通过HE切片也观察到,发酵方竹笋可以降低便秘对小肠造成的损伤,减少小肠绒毛的断裂,效果优于未发酵方竹笋。同时发酵方竹笋较对照组可以显著升高小鼠血清中的胃动素(MTL)、内皮素-1(ET-1)、血管活性肠肽(VIP)和乙酰胆碱酯酶(AchE)水平。由此可见,发酵方竹笋具有较好的便秘预防效果。

方竹笋,发酵,便秘,地芬诺酯

方竹(Chimonobambusaquadrangularis(Fenzi)Makino),禾本科竹亚科寒竹属植物[1],主产于我国渝黔地区高海拔的丛林中,其竹笋是无污染的天然优质食品[2]。方竹笋一般在秋季成熟,其出产时间与大多数竹笋不同,从而具有特殊的品质。方竹笋营养成分丰富,含有蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素C、维生素B族和钙、磷、铁、锌、硒等矿物质元素,此外还含有丰富的纤维素[3]。发酵可以提高食品原有的品质,包括改善口味、增加营养成分和改善营养素比例等;利用微生物发酵可改善竹笋中膳食纤维的生理功能[4]。

在现代社会中,便秘是一种常发的生理状态,出现便秘状态的人群排便次数下降且由于粪便的水分含量下降导致单次排便量下降和排便困难[5]。由于工作状态等的影响,现代人群中有约70%的人处于亚健康状态,处于亚健康状态的人群多有肠胃不适的表现,这其中又有相当多的人群处于便秘状态。食用包括保健食品在内的具有改善身体状态和机能的食品可以使亚健康状态人群恢复正常,而通过食品改善便秘状态正是当今提倡的改善肠道健康的重要方式[6]。竹笋中的纤维已经被证实具有很好的抑制便秘的作用[7],有研究报导经发酵后竹笋中的膳食纤维可以获得改善,经过发酵的竹笋对便秘的作用得到了提高[8]。

复方地芬诺酯是一种治疗功能性腹泻的药物,可以阻滞肠粘膜上的受体,减轻肠道蠕动使肠内容物通过发生延迟,正常状态下服用可导致便秘[9],利用复方地芬诺酯的这个药理作用,采用其诱导小鼠便秘建立动物便秘模型已经成为检验食品抑制便秘效果的重要实验手段[10]。本研究利用复方地芬诺酯片诱导小鼠产生便秘状态,观察发酵方竹笋对复方地芬诺酯片诱导便秘的预防作用,对采用发酵方式对方竹笋的进一步开发利用提供了新的理论支持,为发酵方竹笋开发成胃肠道功能性食品提供了基础的实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜方竹笋 由重庆雪瑞盛泉农业开发有限公司提供。复方地芬诺酯片 国药准字H32022716常州康普药业有限公司;比沙可啶 美国Sigma公司;小鼠胃动素(MTL)、内皮素-1(ET-1)、血管活性肠肽(VIP)ELISA Kit 武汉华美生物工程有限公司;小鼠乙酰胆碱酯酶(AchE)试剂盒 南京建成生物工程研究所;其余试剂均为国产分析纯。

嗜酸乳杆菌LA2和乳链球菌LS3分离自新鲜方竹笋壳。

SPF级6周龄雌性昆明小鼠100只 动物许可证号:SCXK(渝)2012-0001,购自于重庆医科大学动物实验中心。

FA2004电子分析天平 上海奕宇电子科技有限公司;SKY-IIIC恒温培养振荡器 上海苏坤实业有限公司;FW177高效粉碎机 重庆迈克科技公司;DHG-9202-2SA恒温干燥箱 常州一诺仪器制造有限公司;UV-1750型紫外分光光度计 日本岛津公司;Y-2A生物研究显微镜 日本尼康公司;TG1650-WS高速离心机 重庆春鑫科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵方竹笋 将培养好的嗜酸乳杆菌LA2和乳链球菌LS3分别以4000 r/min离心10 min,弃上清培养基,再用适量无菌生理盐水洗涤一次,最后用生理盐水重悬,调整菌液的浓度为7.5×109cfu/mL,植物乳杆菌和嗜热链球菌菌液按1∶1比例混合制成方竹笋发酵菌液。取鲜方竹笋5 kg洗净后适度破碎,加入500 mL混合发酵菌液在42 ℃下主发酵16 h,4 ℃下后发酵12 h,制成发酵方竹笋。

1.2.2 竹笋纤维显微镜观察 将新鲜方竹笋和发酵方竹笋用粉碎机粉碎后,用10倍质量生理盐水清洗3次,弃去液体后加入10倍质量95%乙醇清洗残留物,以1000 r/min离心5 min,弃去上层液体。将洗净固体取小块压片并滴3滴亚甲基蓝1%乙醇溶液染色,制成方竹笋纤维玻片标本,在显微镜下放大20×5倍观察。

1.2.3 竹笋饲料制作 将新鲜方竹笋和发酵方竹笋巴氏灭菌后烘干,然后将烘干后的方竹笋和发酵方竹笋粉碎,按重量比1∶9分别与小鼠饲料混合并压制成型,得到含10%新鲜方竹笋和发酵方竹笋的实验小鼠饲料。

1.2.4 小鼠便秘实验 将实验小鼠随机分为正常组、对照组、比沙可啶治疗组、方竹笋喂养组和发酵方竹笋喂养组,每组10只。正常组小鼠实验过程中不进行任何处理;对照组小鼠在实验的前6 d不进行任何处理,6 d后每天给小鼠灌胃复方地芬诺酯悬液(5 mg/kg)一次,连续灌胃3 d;比沙可啶治疗组小鼠在实验过程中每天给小鼠灌胃比沙可啶(100 mg/kg)一次,同时在6d后除继续灌胃比沙可啶外每天还给小鼠灌胃复方地芬诺酯悬液(5 mg/kg)一次,连续灌胃3 d;在实验过程中以上三组小鼠均给予自由摄入饮水和普通小鼠饲料。方竹笋喂养组和发酵方竹笋喂养组小鼠在实验过程中分别给予小鼠含10%方竹笋和10%发酵方竹笋的饲料,同时小鼠给予自由摄入饮水,在实验的后3 d每天灌胃一次复方地芬诺酯悬液(5 mg/kg)。所有小组小鼠在实验进行9 d后给予绝食24 h,然后给所有小鼠按浓度0.1 mL/10 g灌胃含10%活性炭冰水。各组10只小鼠平均分为两部分,5只小鼠观察排出首粒黑便的时间,5只小鼠灌胃活性炭冰水30 min后断颈处死后观察活性炭在小肠中的推进率,推进率(%)=活性炭在小肠中推进距离/小肠总长度×100[11-12]。

1.2.5 血清指标检测 小鼠血液在4500 r/min转速下离心10 min,吸取上层清液获得小鼠血清,按照小鼠胃动素(MTL)、内皮素-1(ET-1)、血管活性肠肽(VIP)和乙酰胆碱酯酶(AchE)试剂盒说明书测定小鼠的MTL、ET-1、VIP和AchE指标。

1.2.6 小鼠小肠病理学观察 小鼠解剖后取小肠放入10%福尔马林溶液中固定24 h,将小肠组织放入95%的乙醇中脱水后放入二甲苯中以替换出组织块中的酒精使小肠组织透明化,然后将已透明的组织块置于溶化的石蜡中浸蜡包埋,通过切片机切片后用苏木精-伊红(HE)染色后制成小鼠小肠病理切片,在显微镜下放大10×5倍观察[13]。

1.3 数据统计

对各项实验重复进行3次,实验结果使用SAS统计软件对所得数据采用one-way ANOVA法分析数据结果在p<0.05水平上是否具有显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 发酵方竹笋与新鲜方竹笋纤维的显微形态观察

由图1可以看到发酵后的方竹笋的纤维较新鲜方竹笋空隙增大,显得更为松弛,新鲜方竹笋纤维紧凑致密,纤维之间的空隙较小。发酵后的方竹笋纤维间隙增大,使水分更容易进入纤维间,增大了竹笋纤维的吸水性和持水力,使纤维素更好的吸收水分膨胀,增加粪便的体积,增强对肠壁的刺激,促进肠蠕动[14];同时使粪便保持更多的水分,防止粪便干燥,有利于排便。有研究也表明发酵可以大大提升竹笋的持水力,与本研究得到了相似的结果[8]。由此可见,发酵对方竹笋纤维产生的作用更有利于排便,可以有效的缓解便秘。

图1 发酵方竹笋与新鲜方竹笋纤维的形态观察(20×5)Fig.1 Morphologic observation of fibers offermented Chimonobambusa quadrangularis shoot andfresh Chimonobambusa quadrangularis shoot(20×5)

2.2 发酵方竹笋与新鲜方竹笋对小鼠首粒黑便排除时间的影响

对绝食24 h小鼠灌胃活性炭水后观察小鼠排出黑便的时间。结果显示,正常组小鼠排出首粒黑便所需时间最短,为62 min(图2);对照组小鼠排出首粒黑便所需时间最长,达到171 min。比沙可啶作为临床上治疗便秘的有效药物,在本研究中作为治疗对照灌胃小鼠,该组小鼠首粒黑便排除时间较对照组大幅度下降(82 min);方竹笋对小鼠(未发酵方竹笋喂养组)排出黑便具有一定的促进作用,使排出黑便的时间减少到117 min;发酵后的方竹笋(发酵方竹笋喂养组)使排出首粒黑便的时间进一步下降,接近药物比沙可啶组小鼠,仅为93 min。便秘患者排便困难,排便的频率较正常人低,小鼠便秘模型模拟人便秘状态,在排便困难的状态下排出由活性炭水产生的黑便的时间可以作为衡量便秘程度的标准[15]。方竹笋中丰富的膳食纤维可以增强肠道的蠕动,促进肠道内容物通过肠道,减少内容物在肠道中滞留时间,发酵后的方竹笋持水性更好,更有利于肠道的蠕动[14],加速内容物的排出,有利于黑便的排出。结果显示食用发酵方竹笋饲料的小鼠的排出黑便的时间显著低于食用方竹笋的小鼠(p<0.05),发酵方竹笋更有利于促进肠道健康,便于排便。

图2 灌胃活性炭水后小鼠排除首粒黑便时间Fig.2 First black stool defecation time ofmice after treating with activated carbon water by gavage注:不同字母表示各组数据平均值具有显著差异(p<0.05)。

2.3 发酵方竹笋与新鲜方竹笋对小鼠粪便的影响

对小鼠诱导便秘后收集各组小鼠每日的粪便,观察便秘对小鼠排便的影响(图3)。由小鼠的粪便状态可以看出正常组小鼠的排便量最大;对照组小鼠的排便量最少;比沙可啶治疗组小鼠的排便量与正常组相近;方竹笋喂养组和发酵方竹笋喂养组小鼠的排便量低于正常组,但大大高于对照组,且发酵方竹笋喂养组的排便量大于方竹笋喂养组。同时正常组、比沙可啶治疗组、发酵方竹笋喂养组小鼠排出的粪便颗粒要大于对照组和方竹笋喂养组。便秘对身体造成的最明显表现就是排便困难,排出的粪便量少且由于水分含量低导致颗粒干蔫[5],由观察实验小鼠的粪便可以看出复方地芬诺酯诱导便秘后对照组小鼠的排便量大大下降,比沙可啶明显的缓解了排便量下降的情况,方竹笋和发酵方竹笋也能起到缓解便秘增大排便的效果,且发酵方竹笋的效果更为优异,明显高于未发酵的普通方竹笋。可见方竹笋是一种很好的缓解便秘的食品,并且发酵可以使其对便秘的缓解作用得到提高。

图3 诱导便秘后小鼠粪便状态Fig.3 Dejection states of mice after inducing constipation

2.4 发酵方竹笋与新鲜方竹笋对活性炭推进率的影响

由图4和表1可以看出活性炭水在正常组小鼠小肠中的推进距离(50.3 cm)和推进率(96.5%)最高,显著高于其他各组小鼠(p<0.05)。对照组小鼠由于诱导便秘,活性炭在小肠中的推进距离(16.7 cm)和推进率(32.2%)最低。比沙可啶治疗组小鼠由于药物的治疗,便秘得到缓解,活性炭的推进距离和推进率较对照组大幅度提高,略低于正常组。活性炭在方竹笋和发酵方竹笋喂养组小鼠小肠的推进较对照组也有较大提高,推进距离和推进率都大于对照组,低于正常组和比沙可啶治疗组(p<0.05),且发酵方竹笋喂养组小鼠小肠中的活性炭比方竹笋喂养组推进得更多,推进率更高。活性炭在小肠中的推进距离和推进率是衡量小肠功能的重要指标,可以判断小鼠的便秘程度,推进距离越长,推进率越高意味便秘的程度更低[15]。从小鼠排出首粒黑便的时间可以看出,由于方竹笋的作用,活性炭黑便在肠道中滞留时间减少,更快速的通过小肠;发酵后的方竹笋效果更为明显,使活性炭尽量多的通过小肠。由此可见,本研究中便秘模型建立后小鼠小肠的活力差异明显,活性炭在正常组和对照组中推进具有显著差异(p<0.05),方竹笋可以显著缓解便秘,使活性炭在小肠中的推进大幅度提高,且发酵后的方竹笋具备比未发酵的方竹笋更好的缓解便秘效果。

表1 发酵方竹笋对活性炭水在便秘小鼠小肠中的推进效果

注:同行不同字母表示各组数据平均值具有显著差异(p<0.05)，表2同。

图4 活性炭在便秘小鼠小肠中的推进情况Fig.4 Propel state of activated carbonin small intestine of constipation mice Small intestineof activated carbon-induced constipation mice

2.5 发酵方竹笋与新鲜方竹笋对小鼠小肠的影响

由图5可以看到正常组小鼠的小肠壁厚度正常,小肠绒毛整齐;对照组小鼠的小肠壁不同的位置厚度不一,小肠绒毛大部分出现断裂变短的现象。比沙可啶治疗组小鼠的小肠壁厚度出现轻微的变化,个别位置出现厚度不均衡,但是小肠绒毛没有出现断裂的现象,整体与正常组小鼠相似。方竹笋喂养组小鼠的小肠壁厚度也出现不均一的情况,相当部分小肠绒毛也出现的断裂;发酵方竹笋喂养组小鼠较方竹笋喂养组仅有小部分小肠绒毛发生的断裂,小肠肠壁厚度接近正常组和比沙可啶治疗组。便秘会导致小肠内壁受到一定的损伤,包括小肠绒毛变短和断裂,影响正常的吸收和排便[13]。活性炭在小肠中滞留的时间越长,碳粒对肠道的影响越大,碳粒随着小肠的蠕动对肠壁造成损伤加大,使更多的小肠绒毛断裂。从整体上看,便秘对小鼠小肠有较大影响,小肠壁的厚度出现不均一状态且小肠绒毛发生断裂,而发酵方竹笋能得到接近比沙可啶减轻便秘对小肠影响的效果,使活性炭通过小肠时间减少,减轻碳粒对小肠绒毛的影响,其作用明显优于新鲜方竹笋。

2.6 发酵方竹笋与新鲜方竹笋对小鼠血清指标的影响

图5 小鼠小肠的形态观察(10×5)Fig.5 Morphologic observation of mice small intestine(10×5)

由表2可以观察到正常组小鼠血清中的MTL、ET-1、VIP和AchE水平显著高于其他各组(p<0.05),对照组小鼠的MTL、ET-1、VIP和AchE水平最低。比沙可啶治疗组、发酵方竹笋喂养组和方竹笋喂养组小鼠的MTL、ET-1、VIP和AchE的血清水平依次降低,都低于正常组高于对照组。胃动素(MTL)是一种能够刺激分泌胃蛋白酶和促进肠道蠕动的胃肠激素,能够有利于肠道的正常生理活动和促进排便[16]。内皮素可以保持血管的张力和保持心血管系统正常,避免便秘造成的其他疾病,内皮素-1(ET-1)是调节心血管功能的重要因子,具有促进血管正常的收缩与舒张、缓解便秘造成的血管收缩不正常等作用[17]。血管活性肠肽(VIP)具有平滑肌松弛和舒张血管的作用,还能增加小肠分泌液的产生和刺激肠道的蠕动,VIP的分泌减少可以直接导致便秘[18]。乙酰胆碱酯酶(AchE)对调整肠道收缩和促进粘液的分泌都有重要的作用,通过增强肠道收缩和肠道内粘液的分泌能使粪便更容易排出,避免便秘[19]。小鼠血清中的MTL、ET-1、VIP和AchE水平会随着便秘程度的增强而降低,本实验中发酵方竹笋较对照组可以显著升高MTL、ET-1、VIP和AchE水平[15],且升高的幅度也大于未发酵的新鲜方竹笋,可见发酵方竹笋对缓解便秘具有很好的效果。

表2 实验小鼠胃动素(MTL)、内皮素-1(ET-1)、血管活性肠肽(VIP)和乙酰胆碱酯酶(AchE)血清水平

3 结论

本研究通过复方地芬诺酯诱导小鼠产生便秘,建立小鼠便秘模型来检测发酵方竹笋对便秘的预防作用。小鼠通过摄取含有发酵方竹笋的饲料模拟人体食用方竹笋的过程,使发酵方竹笋在小鼠体内发挥作用。观察活性炭在小鼠体内作用发现,食用发酵方竹笋饲料的小鼠排出黑便的时间小于对照组小鼠和食用方竹笋饲料的小鼠,略高于正常小鼠和比沙可啶处理小鼠;活性炭在食用发酵方竹笋饲料的小鼠小肠中的推进率也得到了相似的结果,低于正常小鼠,高于对照小鼠和方竹笋喂养小鼠。通过HE切片观察到便秘可以使小肠受到损伤、小肠壁和小肠绒毛形态受到显著影响;发酵方竹笋可以明显缓解和降低便秘造成的不良影响。通过检测小鼠血清中的胃动素(MTL)、内皮素-1(ET-1)、血管活性肠肽(VIP)和乙酰胆碱酯酶(AchE)水平也发现,发酵方竹笋相对对照组可以显著升高以上指标,使上述血清指标接近正常组小鼠。对发酵方竹笋纤维的进一步研究发现发酵过程可以改善方竹笋的纤维结构,使纤维有更好的缓解便秘效果。由以上结果可以得出发酵方竹笋可以提高方竹笋原有的便秘预防效果,是一种优质的缓解便秘的发酵食品。

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Preventive effect of fermentedChimonobambusaquadrangularisshoot on diphenoxylate induced constipation

LI Gui-jie1,2,3,4,5,6,WANG Cun2,3,4,5,KUANG Gang2,3,4,5,CHEN Shao-cheng2,3,4,5,XIONG Zheng-wei2,3,4,5,ZHAO Xin2,3,4,5,6,*

(1.College of Food Science,Southwest University,Chongqing 400715,China;2.Department of Biological and Chemical Engineering,Chongqing University of Education,Chongqing 400067,China;3.Chongqing Engineering Laboratory of Functional Food,Chongqing University of Education,Chongqing 400067,China;4.Chongqing Enterprise Engineering Research Center of Functional Food,Chongqing University of Education,Chongqing 400067,China;5.Chongqing Collaborative Innovation Center of Functional Food,Chongqing University of Education,Chongqing 400067,China;6.Institute of Functional Ecological Food,Chongqing University of Education,Chongqing 400067,China)

This study was to determine the preventive effect of fermentedChimonobambusaquadrangularisshoot(FCQS)on diphenoxylate induced constipation in mice. The FCQS had more loosened fiber tissue structure than unfermentedChimonobambusaquadrangularisshoot(UCQS),which was more helpful to relieve constipation. After the mice were fed with FCQS for 9 days,the time consumption for their first black stool defecation was shorter than the control group and UCQS groups but longer than normal group and bisacodyl treatment group. The gastrointestinal transit of FCQS group was higher than control group and UCQS group,but lower than normal group and bisacodyl group. By observing the HE section of mice intestine,it was found that FCQS reduced the injury of intestinal tract suffering from constipation and alleviated the damages of the intestinal villi which were better than UCQS played. FCQS also can increase the serum levels of MTL(motilin),ET-1(endothelin-1),VIP(vasoactive intestinal peptide)and AchE(acetylcholinesterase)comparing with the control group. These results showed that FCQS had good preventive effect on constipation.

Chimonobambusaquadrangularisshoot;fermentation;constipation

2014-11-24

李贵节(1983-)，男，硕士，副教授，研究方向:功能性食品及食品营养与安全，E-mail:ligj@cque.edu.cn。

*通讯作者:赵欣(1981-)，男，博士，教授，研究方向：功能性食品及食品营养与安全，E-mail：foods@live.cn。

重庆市教委科学技术研究项目(KJ1401411)；重庆第二师范学院创新团队计划(KYC-cxtd03-20141002)；重庆高校创新团队建设计划资助项目( KJTD201325)。

TS201.1

A

1002-0306(2015)15-0357-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.067