碳、氮源对红曲黄色素色价和色调值的影响

毛 鹏,张薄博,许赣荣

(江南大学生物工程学院,江苏无锡 214122)

碳、氮源对红曲黄色素色价和色调值的影响

毛 鹏,张薄博,许赣荣*

(江南大学生物工程学院,江苏无锡 214122)

本文对红曲黄色素发酵条件进行了探究,红曲菌sjs-6发酵所得红曲黄色素,仅在420 nm处有单吸收峰。不同碳源种类对色素产量有较大影响,对产色素种类影响不大;氮源对黄色素种类和产量均有较大影响,有机氮源可促使橙、红色素的产生,而无机氮源更有利于单产黄色素。发酵进程曲线显示,72～120 h,菌体量处于稳定水平,是红曲菌sjs-6产黄色素的关键时期,120 h之后随着碳源耗尽,菌体自溶,产色素能力下降,色价保持稳定。通过正交实验可得,当以6%(w/v)玉米淀粉为碳源,0.4%(w/v)硫酸铵为氮源时,培养基初始pH为5.0,发酵温度为30 ℃时,发酵144 h,黄色素色价可达378 U/mL。产量是国内现有报道水平(110 U/mL)的3倍多。由于菌株非突变株,具有较好的稳定性。由此,为实现红曲黄色素的工业化生产奠定了基础。

红曲,黄色素,发酵条件,色价,正交实验

红曲色素分为红色素(Rubropunctamine与Monascorubramine)、橙色素(Rubropunctatine与Monascorubrine)和黄色素(Ankaflavine与Monascin)[1]。从食品的颜色上看,使用黄色素的场合日渐增多,例如饮料、食用油、酱、肉、糕点等食品都以黄色为主。目前的许多果汁饮料都采用化学合成色素。如果采用天然黄色素替代,色素产量将相当可观。微生物发酵方法生产天然红曲黄色素不受季节影响,成本较低,转化率高,且基本安全无毒,发展前景十分广阔[2]。

红曲红色素已实现了工业化生产,但红曲黄色素仍处于研究、开发阶段,研究者大都采用诱变方式改造菌种以期提高黄色素产量[3-4],发酵依然停留在摇瓶水平,且色价及色调值偏低。如华南理工大学周波等人通过选育突变株进行液态发酵,其黄色素色价仅达到110 U/mL[3],并不适合工业生产。泰国科学家通过诱变得到单产黄色素的菌株,固态[5-6]与液态发酵[7]方面都有一定研究成果,但仍未实现工业化生产。日本目前已实现了红曲黄色素的工业化生产,产品名为日本天然No.393[8]。

红曲色素的生物合成途径并不是完全清楚,研究表明,红曲红、黄色素均由橙色素转化而来。因此控制橙色素的转化路径尤为关键。橙色素在一定的条件下若转化为红色素,则不仅改变了红曲色素的类型,更减少了黄色素的产量。在获得生产菌种及发酵新方法的基础上[9],从红、黄、橙色素的分子结构推测,培养基中碳、氮源的种类及浓度有可能是控制黄色素色价及发酵液色价的因素之一。本课题在前人研究[9-10]的基础上,又经过不断的菌种筛选,确定了最佳红曲菌株后,再从培养基碳、氮源的角度进一步深入研究其对黄色素色价及色调的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红曲菌sjs-6 江南大学固态发酵研究室保藏菌种。

PDA培养基(g/L) 马铃薯 200,葡萄糖 20,琼脂20,pH自然;种子培养基(g/L) 玉米淀粉40,玉米浆粉 10,酵母膏10,KH2PO42.0,K2HPO42.0,MgSO4·7H2O 0.5,初始pH为4.0。摇瓶发酵基本培养基(g/L) 碳源60,氮源5.0,KH2PO42.0,K2HPO42.0,MgSO4·7H2O 0.5,CaCl20.1,FeSO4·7H2O 0.01,ZnSO4·7H2O 0.01,MnSO4·H2O 0.03,NaNO32.0,初始pH为4.0。

HY-G-a型回旋式恒温调速摇床柜 上海跃进医疗器械厂;U3900型紫外可见分光光度计 日立;PYX-XHS-405型电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂;KDC-16H型台式高速冷冻离心机 Sigma公司。

1.2 种子培养与发酵方法

斜面菌种在30 ℃下恒温培养7～10 d,使菌产生孢子;种子液在30 ℃,180 r/min 培养2～3 d;采用新型萃取发酵的方法(专利号:201410116854.6),摇瓶发酵条件为50 mL/500 mL装量,180 r/min,30 ℃培养5 d。发酵实验设三个平行,计算平均值。

1.3 发酵正交实验设计

选择玉米淀粉浓度、硫酸铵浓度、培养温度、培养基初始pH作为考察因素,以黄色素色价为考察指标,进行了四因素三水平的正交实验,具体因素及对应水平如表1所示。

表1 正交实验因素水平表

1.4 发酵液色价及色调测定方法

[11]，将发酵液用研磨混匀后取5 mL于50 mL比色管中,用75%的乙醇定容至50 mL,置于55 ℃恒温水浴中浸提1 h。冷却至室温后6000 r/min离心5 min。用相同浓度的乙醇稀释,并以同种乙醇为空白对照在420 nm处进行全波长扫描,测定OD值。

黄色价(U/mL)=OD420×总稀释倍数

色调值=OD420/OD505

1.5 菌体量测定方法

将发酵液充分混合均匀后精确量取10 mL过滤,滤渣用蒸馏水洗涤3次后用烘干至恒重的滤纸(m1)抽滤,105 ℃烘干至恒重。用电子天平称菌体和滤纸总重量,记作m2。菌体量记作X。

X(g/L)=(m2-m1)/10-2

1.6 总糖测定

采用苯酚硫酸法测定发酵液中的总糖含量[12]。

2 结果与讨论

2.1 碳源种类对黄色素发酵的影响

本文分别选择了6%(w/v)葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、糊精、玉米淀粉、马铃薯淀粉、糯米粉(后三者均不含氨基酸、蛋白质类物质)作为碳源。结果表明,淀粉、米粉类的碳源较麦芽糖等简单碳源更适合黄色素发酵。如图1所示,产黄色素效果:玉米淀粉>马铃薯淀粉>糯米粉>糊精>麦芽糖>蔗糖>葡萄糖。

图1 不同碳源种类对黄色素色价及色调的影响Fig.1 Effects of different carbon sourceson yellow pigments yields

当以玉米淀粉为碳源时,黄色素的色价达到200 U/mL以上,红曲菌液态发酵过程中,淀粉、米粉等碳源成分相对复杂,会在红曲菌自身产生的淀粉酶和糖化酶的作用下根据红曲菌自身的需要缓慢分解,使发酵液中可利用的单糖浓度始终维持在较低水平,不会造成菌体的大量生长,同时有利于次级代谢产物红曲色素的产生和积累。同时,玉米淀粉中不含氨基酸、蛋白质类物质,避免了蛋白类物质与橙色素反应生成红色素。而葡萄糖作为底物时色价最低,不到100 U/mL,有报道,这可能是因为葡萄糖属于速效碳源,高浓度的葡萄糖作为底物时,会产生乙醇,从而抑制了菌体的生长和色素的合成[13-14]。

2.2 氮源种类对黄色素发酵的影响

分别以蛋白胨、酵母膏、尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵六种氮源以0.5%(w/v)的浓度进行发酵。从不同氮源发酵所产红曲色素的全波长扫描图(见图2、图3)发现,硫酸铵等无机氮源产生的红曲色素,在300～600 nm之间吸收峰单一,位于420 nm处;而有机氮源产生的红曲色素有多个吸收峰,说明以蛋白胨等有机氮源发酵会产生多种色素。如图3所示,蛋白胨作为氮源时产生的红曲色素吸收光谱曲线在404 nm和501 nm处有吸收峰;氮源为酵母膏时产生的红曲色素的光谱吸收曲线在405 nm及465 nm处有吸收峰;尿素为氮源时光谱吸收峰在371 nm和510 nm左右。由此得出,硫酸铵等无机氮源更适合黄色素发酵,同时也验证了周波等人[15]对无机氮源更有利于红曲菌产黄色素的报道。

图2 无机氮源发酵产生黄色素的全波长扫描图Fig.2 Spectral absorption curves ofyellow pigments produced by inorganic nitrogen sources

图3 无机氮源发酵产生黄色素的全波长扫描图Fig.3 Spectral absorption curves ofyellow pigments produced by organic nitrogen sources

由于红曲菌在代谢过程中会产生蛋白酶,有机氮源(蛋白胨、酵母膏、尿素)作为红曲菌sjs-6发酵的氮源时,会被分解产生多种氨基酸,很容易与发酵产生的橙色素发生反应,从而将橙色素转变成红色素[16],同时减小了通往黄色素合成方向的代谢流,因此由有机氮源发酵产生的红曲色素的全波长扫描图中会有多个吸收峰。无机氮源中不含氨基酸类物质,所以不会出现该种现象。

不同种类的氮源发酵产生的黄色素色价(420 nm处)如表2所示,三种无机氮源对应的黄色素色价都在200 U/mL以上,其中硫酸铵为氮源时黄色素色价可以达到258 U/mL。而有机氮源产生的色素在420 nm处均不具有吸收峰。

2.3 发酵条件正交优化实验

在确定了红曲菌sjs-6发酵红曲黄色素的最佳碳源和氮源分别为玉米淀粉和硫酸铵之后,为了进一步考察多种因素对发酵的影响,进行了四因素三水平正交实验,结果如表3所示。

表2 不同氮源种类对红曲菌sjs-6产色素的影响

表3 四因素三水平正交结果

表4 红曲黄色素液态发酵条件及黄色素产量比较

实验表明,四个因素对红曲菌sjs-6发酵产红曲黄色素影响程度:玉米淀粉浓度>培养温度>培养基初始pH>氮源浓度。玉米淀粉作为碳源是红曲菌发酵过程中一大重要因素,其浓度影响着菌体的生长进而影响色素的最终产量,此外,红曲菌sjs-6发酵过程对温度,pH这两个条件也相对敏感,温度在2 ℃范围内波动依然对黄色素的产量有较大影响。因此,在发酵控制中应对这两个因素进行严格控制。从k值来看,最优组合为A2B2C2D3。由表3中可见,现有组合A2B1C2D3黄色素的产量可达到最高水平,色价为316.0 U/mL，两个组合仅硫酸铵浓度不同。对A2B2C2D3与A2B1C2D3两组进行进一步实验比较,得出,A2B2C2D3((322.7±5.3)U/mL)优于A2B1C2D3((317.4±4.5)U/mL)，色价相差不大。综合原料成本，故选择玉米淀粉浓度为6%(w/v),硫酸铵浓度为0.4%(w/v),培养基初始pH为5.0,培养温度30 ℃(A2B1C2D3)为红曲菌sjs-6产红曲黄色的发酵条件。鉴于本次实验采用的是摇瓶发酵,发酵液pH的实时变化情况尚不清楚,其对发酵产色素的影响仍需进一步研究。

2.4 菌体生长与底物消耗及色素生成的关系

红曲黄色素作为红曲菌的一种次级代谢产物,其发酵类型属于生长非偶联型发酵,由图4可见,0～18 h菌体生长缓慢,属于菌体生长的迟滞期;24～72 h菌体量迅速增长,达到30 g/L以上;随后菌体量一直维持在该水平,呈现稳定的状态。0～72 h阶段,色素增长较为缓慢;72～120 h阶段,色素生成速度呈直线上升态,是色素生成的黄金时期,120 h以后菌体生长呈现出衰退,色素浓度依然处于缓慢的上升状态,但其增长速度呈现出减小趋势(120～144 h),在144 h时黄色素色价达到378 U/mL,接下来的24 h,色价仅增长了7 U/mL,之后基本处于稳定,原因可能是碳源基本耗尽,菌体开始出现自溶,产色素能力下降导致产物增长缓慢,浓度趋于稳定。因此,在优化的发酵条件下将144 h(6 d)作为一个发酵周期更为合适。在发酵过程中保证充足的碳源,维持菌体的生产状态是黄色素生产的一大关键。上述发酵结果是在分批发酵的基础上得到的,流加发酵仍有待进一步研究。

图4 红曲菌sjs-6的发酵进程曲线Fig.4 Fermentation process curveof Monascus sp. sjs-6

2.5 红曲黄色素液态发酵条件研究及产量比较

在红曲黄色素液态发酵研究方面,目前已有的研究中,黄色素的最大吸收波长有330、370、410 nm三种。仅有泰国的B.Yongsmith等人由诱变获得的突变株所产黄色素色价可达到600 U/mL(吸收峰在370 nm);而国内周波的诱变菌株发酵液色价仅有110 U/mL[3]。突变菌株具有不稳定的特点,因此,保持菌种及其产量的稳定性是一大关键,本研究所用菌株为实验室保藏的原始菌株,未经诱变,不会存在回复突变等隐患,具有较好的稳定性,相对适合发酵放大及生产。

3 结论

碳、氮源的种类及浓度对红曲菌sjs-6发酵产红曲黄色素均有较大影响。相比于简单碳源淀粉类复杂碳源更有利于提高黄色素产量,其中玉米淀粉效果最好;氮源的种类对色素的种类有显著影响,无机氮源发酵仅产生单一的黄色素,而有机氮源发酵会产生多种其他色素,氮源优选硫酸铵。正交实验表明,浓度为6%(w/v)的玉米淀粉,0.4%(w/v)的硫酸铵,培养基初始pH为5.0,培养温度30 ℃更适合红曲菌sjs-6发酵产红曲黄色素。在优化的条件下以144 h(6 d)作为发酵周期,黄色素色价可以达到370 U/mL以上,进而为发酵放大以至生产的实现奠定了产量基础。

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Impacts of carbon and nitrogen sources on color value and tone value of yellowMonascuspigments

MAO Peng,ZHANG Bo-bo,XU Gan-rong*

(School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

In this study,the fermentation conditions for the yellow pigments produced by submerged fermentation ofMonascussp. sjs-6 were investigated. It was found that the carbon sources varieties had large impact on the output ofMonascusyellow pigments. However,not only the yield but also the kinds of pigment were affected by different nitrogen sources of culture medium. Organic nitrogen source could promote the production of orange,red pigment,but inorganic nitrogen source was good at the production of yellow pigment. Incubating at 30 ℃ for 6 days,a high yield(378 U/mL)ofMonascusyellow pigments(MYP)was obtained in the optimum fermentation medium,in which,6%(w/v)corn starch,0.4%(w/v)(NH4)2SO4was used as the carbon,nitrogen source,respectively with initial pH of 5.0. Moreover,the MYP had single absorption peak at 420 nm which was different from the studies by other researchers. The yield of MYP presented in this research was more than 3 times over the other reports in our country. As it was a wild strain without mutant,the strain was relatively stable than the mutant strains reported by other researchers. So,this study would lay a foundation for the subsequent large scale production of MYP.

Monascus;yellow pigments;fermentation conditions;color value;orthogonal test

2014-09-22

毛鹏(1990-)，女，硕士在读，主要从事微生物天然色素发酵方向研究,E-mail:maopeng15@163.com。

*通讯作者:许赣荣(1957-)，男，博士，教授，主要从事红曲色素及功能性红曲研究，E-mail:grxu123@126.com。

国家十二五科技支撑计划项目(2011BAD23B02)。

TS202.3

A

1002-0306(2015)15-0165-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.027